對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）是對蝦和其他甲殼類動物的重要病原體,目前已有4個毒株完成全基因組測序,其編碼基因180個ORF,但對于大部分的基因的功能尚不清楚。為了深入開展WSSV功能基因組研究,本文構(gòu)建了病毒基因表達(dá)庫,可在原核細(xì)菌和真核細(xì)胞中進(jìn)行相關(guān)研究。本實驗采用iel p（-94+52）和T7啟動子成功構(gòu)建了穿梭載體,該載體可啟動基因在E.Coli和High Five細(xì)胞中表達(dá)。利用該載體成功克隆162個WSSV的基因,其中,在E.Coli中,共94個克隆可以表達(dá)。在High Five細(xì)胞中,共102個克隆可以表達(dá)。該基因表達(dá)庫的構(gòu)建為今后相關(guān)基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。WSV249已被證明是E3連接酶,但還沒找出其作用的底物及其泛素化途徑。前期實驗初步認(rèn)為WSV249表達(dá)定位在核周及中心體。本實驗利用構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒,在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)WSV249并觀察其在昆蟲細(xì)胞High Five的定位,發(fā)現(xiàn)其可能定位于中心體上。轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞293T中與中心體共表達(dá)定位,確定WSV249在細(xì)胞中表達(dá)定位在中心體上。這一研究結(jié)果為今后尋找WSV249的泛素化底物指明方向。 

【文章來源】：廈門大學(xué)福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1.前言
    1.1. 對蝦白斑綜合癥病毒研究概況
    1.2. 對蝦白斑綜合癥病毒的發(fā)現(xiàn)及命名
        1.2.1. 對蝦白斑綜合癥病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.2. 對蝦白斑綜合癥病毒的生活周期
        1.2.3. 對蝦白斑綜合癥病毒的分離純化
    1.3. 對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)基因組學(xué)研究概況
    1.4. 對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)蛋白的功能研究
        1.4.1. WSSV的非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.4.2. WSSV的結(jié)構(gòu)蛋白
    1.5. WSSV泛素化相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展
        1.5.1. 蛋白質(zhì)降解的泛素-蛋白酶體途徑
        1.5.2. WSSV泛素化相關(guān)蛋白研究進(jìn)展
    1.6. 不依賴于連接反應(yīng)克隆(LIC)
2. 本論文研究的內(nèi)容、目的和意義
第一部分 對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)基因表達(dá)庫的構(gòu)建
    1. 前言
    2. 實驗材料與方法
        2.1. 實驗材料
            2.1.1. 實驗動物
            2.1.2. 菌株與質(zhì)粒
            2.1.3. 細(xì)胞和培養(yǎng)基
            2.1.4. 試劑盒
            2.1.5. 酶類
            2.1.6. 抗生素
            2.1.7. 引物合成及測序
            2.1.8. 抗體
            2.1.9. 其他試劑
        2.2. 實驗方法
            2.2.1. 穿梭載體的設(shè)計
            2.2.2. LIC法構(gòu)建WSSV基因表達(dá)文庫
            2.2.3. 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)鑒定
            2.2.4. 在昆蟲細(xì)胞High Five表達(dá)鑒定
    3. 結(jié)果與分析
        3.1. 穿梭載體pIZ-IE1P-T7P-Flag/HA的設(shè)計
            3.1.1. 啟動子區(qū)的設(shè)計
            3.1.2. 多克隆位點的設(shè)計
        3.2. 穿梭載體pIZ-IE1P-T7P-Flag的構(gòu)建及表達(dá)驗證
            3.2.1. 基因合成
            3.2.2. 穿梭載體構(gòu)建
            3.2.3. 表達(dá)驗證
        3.3. LIC法構(gòu)建WSSV基因表達(dá)文庫
        3.4. WSSV基因表達(dá)文庫表達(dá)鑒定
            3.4.1. 在E.Coli中檢驗表達(dá)情況
            3.4.2. 在High Five細(xì)胞中檢驗表達(dá)情況
    4. 討論
第二部 WSV249蛋白的細(xì)胞中表達(dá)及定位
    1. 前言
    2. 實驗材料與方法
        2.1. 實驗材料
            2.1.1. 質(zhì)粒
            2.1.2. 細(xì)胞和培養(yǎng)基
            2.1.3. 抗體
        2.2. 實驗方法
            2.2.1. 甲醇固定
            2.2.2. 亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組抽提(ProteoExtract Subcellular Proteome ExtractionKit)
            2.2.3. WSV249蛋白單克隆抗體制備
            2.2.4. WSV249蛋白單克隆抗體選用
            2.2.5. 中心體抗體的選用
            2.2.6. WSV249的細(xì)胞定位
    3. 結(jié)果與分析
        3.1. 在E.Coli和High Five中表達(dá)WSV249蛋白
        3.2. 亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的抽提確定WSV249蛋白所屬細(xì)胞亞組分
        3.3. 篩選可用的WSV249抗體
        3.4. WSV249與中心體免疫熒光共定位
            3.4.1. 293T細(xì)胞表達(dá)WSV249及其表達(dá)定位
            3.4.2. 中心體抗體選用
            3.4.3. 共定位
    4. 討論
參考文獻(xiàn)
附錄1 主要儀器設(shè)備
附錄2 常用溶液和培養(yǎng)基配制
附錄3 WSSV基因表達(dá)庫引物設(shè)計表及檢驗表達(dá)結(jié)果匯總表
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]泛素化途徑與細(xì)胞周期的關(guān)系[J]. 周蕊,余澤華.  生命科學(xué). 2003(03)
[2]對蝦白斑綜合征桿狀病毒體內(nèi)增殖模型的建立[J]. 黃燦華,石正麗,張建紅,張立人,陳棣華,J．R．Bonami.  中國病毒學(xué). 1999(04)
[3]用對蝦的致病病毒人工感染克氏原螯蝦[J]. 魏靜,陸承平,楊叢海.  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 1998(04)



本文編號：3285763