研究背景先天免疫是生物體在長期的進(jìn)化中獲得的一種抵御外界病原微生物入侵的天然防御機制,是宿主啟動免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。無脊椎動物僅具備先天免疫系統(tǒng),因而是研究先天免疫應(yīng)答機制的理想生物。無脊椎動物先天免疫研究在以果蠅和線蟲為代表的模式生物中取得了較大的進(jìn)展,獲得了深入的認(rèn)識。近年來,以對蝦為代表的海洋無脊椎動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,但也頻繁遭受病害的侵襲。因此,需要深入研究對蝦的先天免疫應(yīng)答機制,為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的病害防控提供理論參考與技術(shù)支持。研究的科學(xué)問題及意義已知,在需氧生物中,由過氧化物歧化酶和過氧化氫酶等組成的抗氧化酶系統(tǒng)在生物體的先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要功能。近期的研究成果表明,過氧化物還原酶（Peroxiredoxin, Prx）,作為一類多功能的、廣泛分布的硫醇依賴性的抗氧化酶,可能參與先天免疫應(yīng)答。但是,其在先天免疫應(yīng)答中的具體功能和發(fā)揮作用的分子機制尚不明確。因此,在本論文中我們選擇具有重要經(jīng)濟(jì)價值的無脊椎動物日本囊對蝦作為實驗材料,深入研究Prx1亞型在對蝦抗白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus, WSSV）先天免疫和1-Cys Prx6亞家族蛋白在對... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
第一章 文獻(xiàn)綜述
    一、生物體抗氧化系統(tǒng)組成
    二、過氧化物還原酶研究進(jìn)展
        1、過氧化物還原酶的發(fā)現(xiàn)、命名、分類
        2. 過氧化物還原酶的酶促反應(yīng)機制
    三.過氧化物還原酶與動物先天免疫
    四、日本囊對蝦中prx基因的鑒定
    五、本論文研究的主要科學(xué)問題
第二章 過氧化物還原酶1在日本囊對蝦抗病毒先天免疫中的功能及其作用機制研究
    一、前言
    二、實驗材料與方法
        1. 實驗材料
            1.1 實驗動物
            1.2 菌株與質(zhì)粒
            1.3 棉鈴蟲表皮細(xì)胞系
            1.4 實驗試劑
        2. 實驗方法
            2.1 病毒感染
            2.2 組織總蛋白質(zhì)提取
            2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.4 重組蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體制備
            2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)
            2.6 RNA干擾實驗
            2.7 存活率統(tǒng)計實驗
            2.8 免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry)
            2.9 核質(zhì)蛋白分離實驗
            2.10 染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)
            2.11 實時定量PCR
            2.12 免疫共沉淀實驗(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
            2.13 HaEpi細(xì)胞系過表達(dá)實驗
            2.14 HaEpi細(xì)胞中MjDorsal~(RHD)結(jié)構(gòu)域二聚化的檢測
    三、結(jié)果
        1、WSSV感染能夠誘導(dǎo)MjPrx1上調(diào)表達(dá)
        2、干擾Mjprx1能夠抑制WSSV在對蝦體內(nèi)的復(fù)制
        3、注射MjPrx1重組蛋白促進(jìn)對蝦體內(nèi)WSSV復(fù)制
        4、干擾Mjprx1抑制MjDorsal的核移位和WSSV ie1啟動子結(jié)合活性
        5、MjPrx1能夠與MjDorsal相互作用并介導(dǎo)其形成二硫鍵連接的同源二聚體
        6. MjPrx1與MjDorsal的相互作用依賴于MjPrx1的Cys51殘基
        7. MjPrx1的Cys51位在其促進(jìn)WSSV復(fù)制的功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用
    四、討論
第三章 1-Cys亞型過氧化物還原酶在日本囊對蝦抗細(xì)菌免疫中的功能與分子機理研究
    一、前言
    二、實驗材料與方法
        1. 實驗材料
            1.1 實驗動物
            1.2 菌株與質(zhì)粒
            1.3 實驗試劑
        2. 實驗方法
            2.1 細(xì)菌感染
            2.2 組織總RNA、蛋白提取
            2.3 cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成
            2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.5 重組蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體制備
            2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)
            2.7 RNA干擾實驗
            2.8 存活率統(tǒng)計實驗
            2.9 實時定量PCR和半定量RT-PCR
            2.10 細(xì)菌清除實驗
            2.11 對蝦體內(nèi)H_2O_2測定
            2.12 注射抗氧化劑NAC和外源H_2O_2
            2.13 重組蛋白回補實驗
    三、實驗結(jié)果
        1、MjPrx6在日本囊對蝦抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮重要作用
        2、干擾Mjprx6抑制鰻弧菌感染誘導(dǎo)的AMP基因上調(diào)表達(dá)
        3、Mjprx6干擾引起對蝦體內(nèi)H_2O_2水平的異常升高
        4、NAC能夠修復(fù)Mjprx6干擾引起的H_2O_2異常升高和AMP基因表達(dá)抑制
        5、MjAlfA1、MjAlfCI和MjAlfC2基因的表達(dá)受H_2O_2濃度的雙向調(diào)節(jié)
        6、MjPrx6重組蛋白能夠修復(fù)Mjprx6干擾組對蝦的異常表型
        7、MjAlfC1和MjAlfC2在對蝦抗細(xì)菌先天免疫中發(fā)揮重要功能
    四、討論
參考文獻(xiàn)
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