發(fā)布時間：2021-04-27 22:57

　　本實驗以鮰愛德華氏菌（Edwarsiella ictaluri）GPY株的基因組DNA為模板,克隆出三段外膜微孔蛋白N全基因（Outer membrane protein, OMP）,并應(yīng)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對其氨基酸序列進行分析。去信號肽和跨膜區(qū)后克隆并表達(dá)了其對應(yīng)的三段功能活性區(qū)域,并通過免疫印跡確定表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性,初步將其確定為亞單位候選疫苗。用表達(dá)的rOmpNs作為抗原,免疫健康斑點叉尾鮰,探究其對斑點叉尾鋼的免疫保護效果。通過本實驗,擬對鮰愛德華氏菌ompNs的生理特性進行初步探討,并為制備具有保護力的抗鮰愛德華氏菌亞單位疫苗提供理論基礎(chǔ)。本研究共分為三個章節(jié),概述如下：1.鮰愛德華氏菌ompN全基因克隆、鑒定和序列特性分析對鮰愛德華氏菌ompNs全基因進行克隆,獲得陽性克隆質(zhì)粒pMD19-T-omp N1、pMD19-T-ompN2和pMD19-T-ompN3。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件分別對opmN1、ompN2和ompN3編碼的氨基酸序列進行分析。結(jié)果顯示鮰愛德華氏菌GPY菌株的ompNs基因編碼的氨基酸序列均含有一個外膜通道蛋白（OM_chann... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1. 鮰愛德華氏菌及生物學(xué)特性
        1.1 鮰愛德華氏菌的發(fā)現(xiàn)及分類
        1.2 鮰愛德華氏菌的生物學(xué)特性
        1.3 鮰愛德華氏菌的血清型
    2. 魚類鮰愛德華氏菌病的臨床癥狀和病理變化
        2.1 鮰愛德華氏菌的感染宿主
        2.2 鮰愛德華氏菌感染的臨床癥狀和病理變化
    3. 鮰愛德華氏菌的毒力因子及致病機制
        3.1 透明質(zhì)酸酶
        3.2 細(xì)胞附屬物
        3.3 脂多糖
        3.4 細(xì)胞膜破壞毒素(MDTs)
        3.5 外膜蛋白
    4. 論文研究的目的意義
第二章 鮰愛德華氏菌ompNs全基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    1. 試驗材料
        1.1 菌株及載體
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要試劑配置
    2. 試驗方法
        2.1 鮰愛德華氏菌ompNs全基因擴增
        2.2 ompNs全基因的T-載體克隆與鑒定
        2.3 生物信息學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 ompNs全基因的擴增、T克隆和鑒定
        3.2 ompNs全基因的核酸序列理化特性分析
        3.4 ompNs全基因編碼的氨基酸序列翻譯后的修飾位點預(yù)測
        3.6 ompNs全基因編碼的氨基酸序列的B細(xì)胞表位預(yù)測
        3.7 ompNs全基因編碼的蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測
    4. 討論
        4.1 ompNs全基因編碼的氨基酸序列特性
        4.2 ompNs全基因編碼的氨基酸序列B細(xì)胞表位分析
第三章 鮰愛德華氏菌ompNs功能活性區(qū)域克隆,原核表達(dá)及免疫原性分析
    1. 試驗材料
        1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞
        1.2 試驗動物
        1.3 主要儀器
        1.4 主要試劑
        1.5 主要溶液及培養(yǎng)基的配置
    2 試驗方法
        2.1 引物設(shè)計與合成
        2.2 PCR擴增
        2.3 純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接
        2.4 T克隆ompNs基因的鑒定
        2.5 表達(dá)載體pET-32a(+)-pompN1/pompN2/pompN3的構(gòu)建和表達(dá)
        2.6 rOmpN1/rOmpN2/rOmpN3的制備與純化
        2.7 兔抗鮰愛德華氏菌多克隆抗體的制備
        2.8 兔抗鮰愛德華氏菌的IgG多克隆抗體的純化
        2.9 Western-blotting檢測rOmpNs特異性
    3. 結(jié)果
        3.1 斑點叉尾鮰pompN1/pompN2/pompN3截段基因的擴增、T克隆和鑒定
        3.2 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-pompN1/pompN2/pompN3誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        3.3 兔抗鮰愛德華氏菌多克隆抗體IgG的制備及效價測定
        3.4 Western-blotting檢測重組rOmpN1/rOmpN2/rOmpN3的特異性
    4 討論
        4.1 表達(dá)區(qū)段的選擇
        4.2 表達(dá)載體的選擇
        4.3. 原核表達(dá)中包涵體的形成及免疫原性分析
第四章 rOmpNs蛋白對斑點叉尾鮰的免疫效果研究
    1. 試驗材料
        1.1 試驗菌株
        1.2 試驗動物
        1.3 主要儀器
        1.4 主要試劑
    2. 試驗方法
        2.1 抗原制備
        2.2 rOmpNs免疫試驗
        2.3 免疫指標(biāo)檢測
        2.4 rOmpNs對斑點叉尾鮰細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄影響
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3. 試驗結(jié)果
        3.1 斑點叉尾鮰抗OmpNs抗體效價檢測
        3.2 補體旁路途徑溶血活性的測定(ACH50)
        3.3 血清溶菌酶活力檢測
        3.4 血清SOD、AKP、ACP總活性和總蛋白含量測定
        3.5 相對免疫保護率
        3.7 Real-time PCR分析斑點叉尾鮰相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況
    4. 討論
        4.1 不同抗原對斑點叉尾鮰血清指標(biāo)的影響
        4.2 不同抗原對斑點叉尾鮰攻毒后死亡率和相對免疫保護率的影響
        4.3 不同抗原對斑點叉尾鮰mRNA水平的影響
結(jié)論
參考文獻
致謝
碩士研究生期間發(fā)表論文情況



本文編號：3164295