基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）是能夠降解細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）的最重要的金屬離子依賴性蛋白酶。MMPs參與許多生理、病理過程，廣泛存在于動、植物和微生物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs參與魚死后肌肉軟化過程中細胞外基質(zhì)的降解，而膠原酶和明膠酶在此過程中起到關(guān)鍵作用。作為一種重要的蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）參與動物膠原蛋白的新陳代謝，但其在水產(chǎn)動物中的存在情況少有報道。本文以淡水鯉魚為研究對象，克隆得到MMP-2基因序列并利用原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)MMP-2催化結(jié)構(gòu)域的體外表達并對重組MMP-2的酶學(xué)性質(zhì)進行深入分析。本研究首先利用RT-PCR和RACE技術(shù)從鯉魚肌肉中克隆得到MMP-2的cDNA全長共2789bp，開放閱讀框共1971bp，編碼657個氨基酸殘基。鯉魚MMP-2含有四個保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端含29個氨基酸殘基的信號肽、前肽結(jié)構(gòu)域、含有三個重復(fù)Ⅱ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域以及C端的類血紅素結(jié)構(gòu)域。利用空間預(yù)測軟件Swiss-model，對鯉魚MMP-2進行同源建模，預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)... 

【文章來源】：集美大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 基質(zhì)金屬蛋白酶簡介
        1.1.1 MMPs 家族特征
        1.1.2 MMPs 的分類
        1.1.3 MMPs 的空間結(jié)構(gòu)
        1.1.4 MMPs 的活性調(diào)節(jié)
        1.1.5 MMPs 的內(nèi)源性抑制劑
    1.2 MMPs 在水產(chǎn)品中的研究現(xiàn)狀
    1.3 MMP-2 的研究
    1.4 本研究的目的和意義
第2章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 動物
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑與材料
        2.1.4 常用溶液及培養(yǎng)基配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 的基因克隆
        2.2.2 生物信息學(xué)分析
        2.2.3 重組蛋白的表達與純化
        2.2.4 重組蛋白的性質(zhì)分析方法
        2.2.5 多克隆抗體的制備
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 鯉魚基質(zhì)金屬蛋白酶-2 的基因克隆
    3.2 鯉魚 MMP-2 的序列分析
        3.2.1 鯉魚 MMP-2 一級結(jié)構(gòu)分析
        3.2.2 鯉魚 MMP-2 的二級結(jié)構(gòu)分析
        3.2.3 鯉魚 MMP-2 的三級結(jié)構(gòu)分析
    3.3 鯉魚 MMP-2 催化結(jié)構(gòu)域蛋白的原核表達
        3.3.1 表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 重組 MMP-2 蛋白的表達與鑒定
        3.3.3 重組 MMP-2 蛋白的純化及活性驗證
    3.4 重組 MMP-2 的性質(zhì)分析
        3.4.1 重組 MMP-2 最適反應(yīng)溫度和最適 pH
        3.4.2 不同蛋白酶抑制劑對重組 MMP-2 活性的影響
        3.4.3 不同金屬離子對重組 MMP-2 活性的影響
    3.5 重組 MMP-2 的降解作用
        3.5.1 重組 MMP-2 對Ⅰ型膠原蛋白的降解作用
        3.5.2 重組 MMP-2 對肌原纖維蛋白的降解作用
        3.5.3 重組 MMP-2 對膠原肽的降解作用
    3.6 鯉魚肌肉中天然 MMP-2 的檢測
    3.7 Ⅱ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)χ亟M MMP-2 活性的影響
        3.7.1 Ⅱ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域基因擴增
        3.7.2 重組 Fnt 和△Fnt 表達質(zhì)粒構(gòu)建
        3.7.3 重組△Fnt 和 Fnt 蛋白的表達與鑒定
        3.7.4 重組△Fnt 和 Fnt 蛋白的純化與活性驗證
第4章 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
致謝
參考文獻
在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3058152