基因編輯技術(shù)是進(jìn)行基因功能研究的重要工具,類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）技術(shù)是近年來發(fā)展最為蓬勃的基因編輯技術(shù)之一。這種基因編輯技術(shù)以其適用范圍廣、操作較為簡便、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)在多種生物中成功運(yùn)用,也在多種魚類中進(jìn)行了實(shí)踐研究,例如斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）和黃顙魚（Tachysurus fulvidraco）等�；蚓庉嬙诟牧计贩N,提高生產(chǎn)效率,治療疾病等方面具有巨大的潛力。斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）作為美國主要淡水養(yǎng)殖品種之一,近年來其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在運(yùn)營成本增高,疾病種類劇增,其他進(jìn)出口冷凍魚等多種因素影響下受到了很大的挑戰(zhàn)。利用基因編輯技術(shù)修改斑點(diǎn)叉尾鮰的基因組成可以極大地提高生產(chǎn)效率,然而,隨之而來的問題是由于基因編輯魚類的泄漏所帶來的生態(tài)安全隱患。絕育技術(shù)可以有效地減小或避免這些隱患。本研究前期利用TALEN和二次電穿孔的技術(shù),在受精卵時(shí)期敲除斑點(diǎn)叉尾鮰的鯰魚型GnRH（Catfish Gona... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

靶向cfGnRH基因的TALEN質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

3.1.3 3 齡時(shí)樣品的收集和分子鑒定3 齡時(shí)，隨機(jī)抽取斑點(diǎn)叉尾鮰突變型 5 尾，非突變型 6 尾，以及野生型斑點(diǎn)叉尾鮰 4 尾，再次取腹鰭和胡須為樣品，依次利用蛋白消化酶 K、蛋白沉淀液和酒精，提取基因組 DNA（Cheng et al., 2014）。接著利用 Roche 高保真 PCR 擴(kuò)增體系（Roche, Indianapolis, IN）擴(kuò)增提取的基因組 DNA 中的 cfGnRH 序列片段。突變結(jié)果同樣是使用 Surveyor Mutation Detection 試劑盒（Integrated DNATechnologies, Coralville, IA）進(jìn)行檢測（Qin et al., 2016）。3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1 高保真 PCR 和 Surveyor CEL-I 突變存在檢測實(shí)驗(yàn)利用高保真 PCR 技術(shù)成功擴(kuò)增出靶向部分 cfGnRH 基因的序列片段，其中包括外顯子 2、3 和 4，大小為 550bp（圖 3-1）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - m

3.3 討論高保真 PCR 體系是 Taq 聚合酶和缺少聚合酶活性的熱穩(wěn)定校正蛋白的混合體。它能夠以極高的精確性擴(kuò)增出達(dá)到 5000bp 大小的 DNA 片段。本研究需要檢測 DNA 序列的突變情況，因此需要利用高保真 PCR 體系，以盡可能地避免擴(kuò)增過程中可能出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配所帶來的突變。CELL-I 突變檢測技術(shù)以及測序結(jié)果顯示，TALEN 技術(shù)已經(jīng)成功引起靶位點(diǎn)圖 3-3 斑點(diǎn)叉尾鮰的測序結(jié)果野生型斑點(diǎn)叉尾鮰的測序結(jié)果在第一行中列出。標(biāo)有下劃線的序列代表 TALEN 結(jié)合部位；紅色字母／破折號(hào)代表 cfGnRH 部位的修飾過的脫氧核糖核苷酸。Fig. 3-3 Sequences results of channel catfishThe wild-type (wt) channel catfish cfGnRH gene sequence is shown at the first line. Sequencesunderlined are the TALEN binding sites; red letters/dashes indicate the modified nucleotides ofcfGnRH gene.


本文編號(hào)：3044606