基因編輯技術是進行基因功能研究的重要工具,類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）技術是近年來發(fā)展最為蓬勃的基因編輯技術之一。這種基因編輯技術以其適用范圍廣、操作較為簡便、效率高、成本低等優(yōu)點,已經在多種生物中成功運用,也在多種魚類中進行了實踐研究,例如斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）和黃顙魚（Tachysurus fulvidraco）等�；蚓庉嬙诟牧计贩N,提高生產效率,治療疾病等方面具有巨大的潛力。斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）作為美國主要淡水養(yǎng)殖品種之一,近年來其養(yǎng)殖產業(yè)在運營成本增高,疾病種類劇增,其他進出口冷凍魚等多種因素影響下受到了很大的挑戰(zhàn)。利用基因編輯技術修改斑點叉尾鮰的基因組成可以極大地提高生產效率,然而,隨之而來的問題是由于基因編輯魚類的泄漏所帶來的生態(tài)安全隱患。絕育技術可以有效地減小或避免這些隱患。本研究前期利用TALEN和二次電穿孔的技術,在受精卵時期敲除斑點叉尾鮰的鯰魚型GnRH（Catfish Gona... 

【文章來源】：上海海洋大學上海市

【文章頁數】：55 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

靶向cfGnRH基因的TALEN質粒結構示意圖

3.1.3 3 齡時樣品的收集和分子鑒定3 齡時，隨機抽取斑點叉尾鮰突變型 5 尾，非突變型 6 尾，以及野生型斑點叉尾鮰 4 尾，再次取腹鰭和胡須為樣品，依次利用蛋白消化酶 K、蛋白沉淀液和酒精，提取基因組 DNA（Cheng et al., 2014）。接著利用 Roche 高保真 PCR 擴增體系（Roche, Indianapolis, IN）擴增提取的基因組 DNA 中的 cfGnRH 序列片段。突變結果同樣是使用 Surveyor Mutation Detection 試劑盒（Integrated DNATechnologies, Coralville, IA）進行檢測（Qin et al., 2016）。3.2 實驗結果3.2.1 高保真 PCR 和 Surveyor CEL-I 突變存在檢測實驗利用高保真 PCR 技術成功擴增出靶向部分 cfGnRH 基因的序列片段，其中包括外顯子 2、3 和 4，大小為 550bp（圖 3-1）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - m

3.3 討論高保真 PCR 體系是 Taq 聚合酶和缺少聚合酶活性的熱穩(wěn)定校正蛋白的混合體。它能夠以極高的精確性擴增出達到 5000bp 大小的 DNA 片段。本研究需要檢測 DNA 序列的突變情況，因此需要利用高保真 PCR 體系，以盡可能地避免擴增過程中可能出現的堿基錯配所帶來的突變。CELL-I 突變檢測技術以及測序結果顯示，TALEN 技術已經成功引起靶位點圖 3-3 斑點叉尾鮰的測序結果野生型斑點叉尾鮰的測序結果在第一行中列出。標有下劃線的序列代表 TALEN 結合部位；紅色字母／破折號代表 cfGnRH 部位的修飾過的脫氧核糖核苷酸。Fig. 3-3 Sequences results of channel catfishThe wild-type (wt) channel catfish cfGnRH gene sequence is shown at the first line. Sequencesunderlined are the TALEN binding sites; red letters/dashes indicate the modified nucleotides ofcfGnRH gene.


本文編號：3044606