魚類出血性敗血癥病毒基質(zhì)蛋白原核表達(dá)、多克隆抗體制備及應(yīng)用
發(fā)布時(shí)間：2021-01-17 06:44
魚類病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Hemorrhagic Septicemia Virus,VHSV）,屬于單負(fù)股RNA病毒目（Mononegavirales）,彈狀病毒科（Rhabdoviridae）,諾拉彈狀病毒屬（Novirhabdovirus）,是一種能侵染虹鱒、牙鲆和大菱鲆等80多種魚類,造成造血器官壞死和爆發(fā)性死亡的病原,給國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病毒基因組編碼的一種結(jié)構(gòu)蛋白-基質(zhì)蛋白（Matrix protein,M）,是一種多功能蛋白,在病毒侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為了對(duì)M蛋白的功能進(jìn)行詳細(xì)研究,本實(shí)驗(yàn)對(duì)M蛋白進(jìn)行了原核表達(dá),并制備了其多克隆抗體。主要內(nèi)容如下:1.M融合蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增VHSV病毒的M基因全長(zhǎng)序列,將目的序列克隆到原核表達(dá)載體pET-32a（+）中,轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。結(jié)果顯示,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為606bp的M基因,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到的M融合蛋白主要以包涵體的形式存在,其大小約為36kDa,比預(yù)計(jì)略小。取切膠純化的M融合蛋白,進(jìn)...
【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省
【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
pBLUE-T-M、pET32a-M重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證M,Super10000DNAmarker250200
目的蛋白表達(dá)的量較多（圖3-2）。圖 3-2 不同條件蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析M：蛋白 maker; S：未誘導(dǎo)的大腸桿菌 BL21（DE3）；1：誘導(dǎo)后樣品 A；2：誘導(dǎo)后樣品 B；3：誘導(dǎo)后樣品 C；4：誘導(dǎo)后樣品 D。Fig. 3-2 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products by different conditionsM, protein marker; S, non-induced Escherichia coli BL21(DE3) ; 1, induced sampleA; 2, induced sample B; 3, inducedsample C; 4, induced sample D;將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和未誘導(dǎo)對(duì)照進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示在約 36kDa 大小的位置出現(xiàn)了差異表達(dá)蛋白，誘導(dǎo)菌體在此處出現(xiàn)了大量表達(dá)的蛋白質(zhì)，其大小比軟件預(yù)測(cè)的理論值略小。超聲破碎處理誘導(dǎo)后的菌體，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，融合蛋白主要存在于沉淀中，以不溶性的包涵體形1000050003000200015007505001000250200bp M pMD18-T-M pET-32a-MM S 1 S 2 S 3 S 4kDa1004030
圖 3-3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析的 BL21（DE3）大腸桿菌；2：誘導(dǎo)；3：誘導(dǎo)上M 融合蛋白，箭頭所示為融合蛋白所在位置-3 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression prodization of non-induced BL21(DE3) Escherichia coli; 2cipitation; 5, purified fusion protein; The target protein驗(yàn)結(jié)果和抗體效價(jià)的檢測(cè)抗原包被的濃度與酶標(biāo)抗抗體的稀釋 0.04 左右，結(jié)果如（表 3-1），當(dāng)包被：1500 時(shí)，OD450值最趨向 1.0，此時(shí)的正式實(shí)驗(yàn)的值。通過(guò)兩次重復(fù)采樣結(jié)果陰性對(duì)照N和空白對(duì)照PBS檢測(cè)數(shù)據(jù)的效價(jià)，如表 3-2 所示，待檢血清效
本文編號(hào)：2982389
【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省
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【部分圖文】：
pBLUE-T-M、pET32a-M重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證M,Super10000DNAmarker250200
目的蛋白表達(dá)的量較多（圖3-2）。圖 3-2 不同條件蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析M：蛋白 maker; S：未誘導(dǎo)的大腸桿菌 BL21（DE3）；1：誘導(dǎo)后樣品 A；2：誘導(dǎo)后樣品 B；3：誘導(dǎo)后樣品 C；4：誘導(dǎo)后樣品 D。Fig. 3-2 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products by different conditionsM, protein marker; S, non-induced Escherichia coli BL21(DE3) ; 1, induced sampleA; 2, induced sample B; 3, inducedsample C; 4, induced sample D;將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和未誘導(dǎo)對(duì)照進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示在約 36kDa 大小的位置出現(xiàn)了差異表達(dá)蛋白，誘導(dǎo)菌體在此處出現(xiàn)了大量表達(dá)的蛋白質(zhì)，其大小比軟件預(yù)測(cè)的理論值略小。超聲破碎處理誘導(dǎo)后的菌體，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，融合蛋白主要存在于沉淀中，以不溶性的包涵體形1000050003000200015007505001000250200bp M pMD18-T-M pET-32a-MM S 1 S 2 S 3 S 4kDa1004030
圖 3-3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析的 BL21（DE3）大腸桿菌；2：誘導(dǎo)；3：誘導(dǎo)上M 融合蛋白，箭頭所示為融合蛋白所在位置-3 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression prodization of non-induced BL21(DE3) Escherichia coli; 2cipitation; 5, purified fusion protein; The target protein驗(yàn)結(jié)果和抗體效價(jià)的檢測(cè)抗原包被的濃度與酶標(biāo)抗抗體的稀釋 0.04 左右，結(jié)果如（表 3-1），當(dāng)包被：1500 時(shí)，OD450值最趨向 1.0，此時(shí)的正式實(shí)驗(yàn)的值。通過(guò)兩次重復(fù)采樣結(jié)果陰性對(duì)照N和空白對(duì)照PBS檢測(cè)數(shù)據(jù)的效價(jià)，如表 3-2 所示，待檢血清效
本文編號(hào)：2982389
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