刺參（Apostichopus japonicus）具有極高的經(jīng)濟價值,是中國北方重要的經(jīng)濟類水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之一。刺參細菌性疾病是困擾刺參養(yǎng)殖業(yè)的主要問題,病原弧菌是其主要的致病菌。為消除病原菌威脅,大量的抗生素和化學類藥物被投入使用,最終導致水環(huán)境污染,菌群微生態(tài)失衡,抗生素殘留,細菌耐藥性產(chǎn)生,制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,因此亟需一種新型的抑菌方式以替代抗生素。到目前為止,國際研究領(lǐng)域的主流替代方式是采用噬菌體療法,關(guān)于噬菌體應用的研究已經(jīng)成為熱點,涉及諸多領(lǐng)域,如農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、食品安全保障行業(yè)等。鑒于此,本課題將噬菌體的應用策略引入到苗期刺參養(yǎng)殖領(lǐng)域,探索噬菌體療法在該領(lǐng)域應用的有效性與安全性。本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下:（1）篩選獲得引發(fā)苗期刺參感染的病原弧菌兩株,分離得到相應病原菌的噬菌體,并對其進行了必要的理化性質(zhì)分析。經(jīng)透射電鏡觀察、生理生化實驗和分子生物學實驗鑒定兩株病原弧菌為嗜環(huán)弧菌和燦爛弧菌,分別命名為嗜環(huán)弧菌VC1和燦爛弧菌VS-ABTNL。采用人工攻毒處理方式,測定了兩株優(yōu)勢病原弧菌的半數(shù)致死量,嗜環(huán)弧菌VC1的半數(shù)致死量LD50值為8.75 × 105... 

【文章來源】：大連理工大學遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 緒論
    1.1 刺參與刺參養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀
        1.1.1 刺參的生物學特征及其營養(yǎng)價值
        1.1.2 刺參經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與瓶頸分析
        1.1.3 弧菌病與刺參腐皮綜合征
        1.1.4 刺參非特異性免疫
    1.2 噬菌體簡介
        1.2.1 噬菌體重要里程碑式事件
        1.2.2 噬菌體分類與生物學特性
        1.2.3 弧菌噬菌體基因組研究
    1.3 噬菌體防控主要水產(chǎn)養(yǎng)殖類致病菌
        1.3.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素替代的必要性分析
        1.3.2 噬菌體防控水產(chǎn)養(yǎng)殖類致病菌
        1.3.3 噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應用前景
        1.3.4 噬菌體保藏
    1.4 論文研究目的及內(nèi)容
2 致病弧菌及其噬菌體的分離純化與理化性質(zhì)
    2.1 引言
    2.2 實驗材料和設備
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 實驗條件
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 主要儀器設備
        2.2.5 引物合成
        2.2.6 溶液配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 病原菌的分離純化
        2.3.2 病原菌生理生化指標測定
        2.3.3 病原菌形態(tài)學鑒定
        2.3.4 病原菌分子生物學鑒定
        2.3.5 病原菌的藥敏分析
        2.3.6 病原菌致病能力檢測
        2.3.7 宿主菌的非溶源性檢測
        2.3.8 裂解性噬菌體篩選分離純化
        2.3.9 噬菌體的擴增與濃縮
        2.3.10 噬菌體效價測定
        2.3.11 噬菌體形態(tài)學觀察
        2.3.12 噬菌體氯仿敏感性測試
        2.3.13 噬菌體宿主譜測定
        2.3.14 噬菌體吸附速率測定
        2.3.15 噬菌體一步生長曲線測定
        2.3.16 噬菌體的體外抑菌效率測定
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 患病刺參的癥狀與病原菌菌落形態(tài)
        2.4.2 兩株病原菌的透射電鏡觀察
        2.4.3 兩株病原菌的生理生化指標
        2.4.4 兩株病原菌的親緣關(guān)系確定
        2.4.5 兩株病原菌的藥物敏感性
50)">        2.4.6 兩株病原菌的半數(shù)致死量與半數(shù)致死濃度(LD₅₀)
        2.4.7 病原菌的非溶源性確定
        2.4.8 噬菌體的噬菌斑形態(tài)
        2.4.9 噬菌體透射電鏡形態(tài)
        2.4.10 噬菌體對氯仿的敏感性
        2.4.11 噬菌體的宿主譜范圍
        2.4.12 噬菌體的吸附速率
        2.4.13 噬菌體的一步生長曲線
        2.4.14 噬菌體的體外抑菌效果
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3的全基因組測序與注釋
    3.1 引言
    3.2 實驗材料和主要儀器設備
        3.2.1 實驗菌株與噬菌體
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 儀器設備
        3.2.4 溶液配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 vibrio phage Vc1和PVS3噬菌體顆粒的純化與濃縮
        3.3.2 CsCl等密度梯度離心及回收
        3.3.3 兩株噬菌體的全基因組DNA提取
        3.3.4 DNA濃度與電泳純度分析
        3.3.5 兩株噬菌體的全基因組測序
        3.3.6 兩株噬菌體基本生物信息學分析
        3.3.7 兩株噬菌體全基因組基因功能預測和蛋白圖譜注釋
        3.3.8 噬菌體的主要功能基因比對與進化分析
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3的全基因組DNA檢測
        3.4.2 高通量測序分析數(shù)據(jù)質(zhì)檢
        3.4.3 高通量測序分析基因含量預測
        3.4.4 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3的基因分布結(jié)果
        3.4.5 噬菌體vibrio phageVc1和PVS3的開放閱讀框預測
        3.4.6 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3的Go數(shù)據(jù)庫分析
        3.4.7 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3基因組的功能基因確定
        3.4.8 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3全基因組蛋白圖譜
        3.4.9 噬菌體vibrio phage Vc1和PVS3的分類地位
        3.4.10 噬菌體胞壁水解酶一級與二級蛋白結(jié)構(gòu)
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
4 噬菌體應用劑型的制備及其防控效果評價
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和設備
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 實驗用細菌菌株和噬菌體
        4.2.3 主要試劑
        4.2.4 儀器設備
        4.2.5 飼料原料
        4.2.6 試劑配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 噬菌體針劑制備
        4.3.2 噬菌體真空冷凍干燥處理最優(yōu)保護劑選擇
        4.3.3 噬菌體浸浴制劑的制備
        4.3.4 攻毒用嗜環(huán)弧菌VC1和燦爛弧菌VS-ABTNL的制備
        4.3.5 噬菌體針劑對刺參的攻毒治療效果考察
        4.3.6 飼喂噬菌體的飼料制備與基礎成分分析
        4.3.7 飼喂噬菌體添加劑對刺參的攻毒保護效果考察
        4.3.8 混合噬菌體制劑對刺參的攻毒保護效果考察
        4.3.9 刺參養(yǎng)殖水體和刺參腸道噬菌體效價測定
        4.3.10 噬菌體注射針劑的溫度與pH耐受性檢測
        4.3.11 不同噬菌體制劑的長期保藏效果考察
        4.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 不同保護劑凍干處理對噬菌體效價的影響
        4.4.2 不同保護劑處理的噬菌體凍干粉的溶解時間
        4.4.3 不同噬菌體凍干處理組的含濕量測定結(jié)果
        4.4.4 噬菌體注射治療效果
        4.4.5 新型飼料基礎成分分析
        4.4.6 嗜環(huán)弧菌噬菌體飼喂保護效果
        4.4.7 燦爛弧菌噬菌體飼喂保護效果
        4.4.8 浸浴混合噬菌體對刺參的保護效果
        4.4.9 飼喂實驗中刺參養(yǎng)殖水體和腸道的噬菌體效價檢測
        4.4.10 浸浴實驗中刺參養(yǎng)殖水體和腸道的噬菌體效價檢測
        4.4.11 噬菌體注射針劑對溫度與pH的耐受性分析
        4.4.12 不同噬菌體制劑長期保藏效果比對
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
5 施用噬菌體對刺參主要生理指標的影響
    5.1 引言
    5.2 實驗材料與設備
        5.2.1 實驗動物及菌種、噬菌體
        5.2.2 主要試劑
        5.2.3 主要儀器設備
        5.2.4 試劑配制
    5.3 實驗方法
        5.3.1 高純度噬菌體顆粒制備
        5.3.2 刺參體腔細胞的提取與原代培養(yǎng)
        5.3.3 噬菌體顆粒與刺參體腔細胞共培養(yǎng)
        5.3.4 噬菌體對刺參吞噬活性影響的考察
        5.3.5 噬菌體對刺參非特異免疫酶活影響的考察
        5.3.6 飼喂噬菌體對刺參非特異免疫酶活影響的考察
        5.3.7 苗期刺參體腔液樣本酶活的測定
        5.3.8 考察飼喂噬菌體對刺參生產(chǎn)狀態(tài)影響
        5.3.9 刺參腸道菌群高通量分析樣品準備
        5.3.10 生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析
        5.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    5.4 結(jié)果
        5.4.1 刺參體腔細胞體外培養(yǎng)相對活性檢測
        5.4.2 體外共培養(yǎng)噬菌體對刺參體腔細胞的影響
        5.4.3 噬菌體共培養(yǎng)對刺參吞噬細胞吞噬活性的影響
        5.4.4 注射噬菌體對刺參主要非特異免疫酶活的影響
        5.4.5 飼喂噬菌體對刺參非特異免疫酶活的影響
        5.4.6 飼喂噬菌體對刺參生長狀態(tài)的影響
        5.4.7 飼喂噬菌體對刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
6 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
附錄A 嗜環(huán)弧菌vibrio phage Vcl ORF在線預測結(jié)果
VspS_VS-ABTNL-3（PVS3）ORF在線預測結(jié)果">附錄B 燦爛弧菌vB_VspS_VS-ABTNL-3（PVS3）ORF在線預測結(jié)果
作者簡介
攻讀博士學位期間科研項目及科研成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]我國刺參產(chǎn)業(yè)發(fā)展狀況、趨勢與對策建議[J]. 李成林,胡煒.  中國海洋經(jīng)濟. 2017(01)
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博士論文
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[5]副溶血弧菌噬菌體qdvp001的分離鑒定及其在牡蠣凈化中的初步應用[D]. 丁云娟.中國海洋大學 2012
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本文編號：2940697