遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是一種重要的魚類病原菌,由它引起的遲鈍愛德華氏菌病對海水魚和淡水魚都具有很高的致死率。為了及時(shí)采取有效措施控制遲鈍愛德華氏菌病的暴發(fā),迫切需要建立便捷、準(zhǔn)確的方法對E. tarda早期感染進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷。本課題制備了E. tarda單克隆抗體和多克隆抗體,并用其制備了E. tarda檢測試紙條,同時(shí)將此方法與斑點(diǎn)雜交和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行了比較。用檸檬酸還原氯金酸的方法制備了各種不同粒徑的膠體金溶液,并用可見光譜和透射電鏡評(píng)價(jià)了膠體金溶液的分散性、形狀以及粒徑分布。選擇粒徑為30 nm的膠體金顆粒標(biāo)記E. tarda多克隆抗體,并將其吸附至玻璃纖維素膜上,將E. tarda多克隆抗體和羊抗兔二抗包被于分析膜上預(yù)定的檢測線（T）和質(zhì)控線（C）上,然后將金標(biāo)墊、樣品墊、分析膜以及吸水墊組裝成檢測試紙條。該試紙條對E. tarda特異性良好,檢測三株E.tarda均為陽性結(jié)果,與其他環(huán)境常見細(xì)菌無交叉反應(yīng)。該試紙條檢測限為107CFU/ml（3-10 min內(nèi)）,延長反應(yīng)時(shí)間后可達(dá)到105 CFU/ml。自漁場采集疑似罹患遲鈍愛德華... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２膠體金檢測試紙條俯視

第Ｈ頁?華東理王大學(xué)碩±學(xué)位論文??口）將ＮＣ膜置于３７°Ｃ環(huán)境中瞭干；??（３）將已劃線的ＮＣ膜浸泡在封閉液中，在３７°Ｃ環(huán)境中封閉１?ｈ；??（４）向一個(gè)潔凈的平皿中加入含有０．０５％?Ｔｗｅｅｎ－２０的ＰＢＳ，并將封閉后的ＮＣ膜置??于平皿中。然后將平皿放在脫色搖床上洗澡２次，每次３?ｍｉｎ；??（５）將洗澡過的ＮＣ膜置于３７°Ｃ環(huán)境中瞭干后，放在４。（：環(huán)境中的干燥器內(nèi)備用。??２．３．３．６樣品墊的預(yù)處理??將玻璃纖維素膜浸泡于樣品墊預(yù)處理溶液中，２ｈ后，將樣品墊取出，于３７°Ｃ環(huán)境??中喊干后，放在４°Ｃ環(huán)境中的干燥器內(nèi)備用。??２．３．３．７試紙條組裝??如圖２．１，首先將分析膜粘貼至ＰＶＣ膠板上。然后，將金標(biāo)墊在上與分析膜重疊２??ｍｍ粘貼在靠前的位置，將吸水墊在上與分析膜重疊２?ｍｍ粘貼在靠后的位置。最后，??將樣品墊在上與金標(biāo)墊重疊２ｍｍ粘貼在最前端。組裝完成么后，用數(shù)控切條機(jī)將其切??成５?ｍｍ寬的試紙條，將試紙條填裝至夾殼內(nèi)。??

真空冷凍干燥后，用抗體重懸液重懸。用考馬斯亮藍(lán)法測得純化的多克隆抗體濃度為??４．７７?ｍｇ／ｍｌ。用甲酸滅活的口Ｗａ菌液包被酶標(biāo)板，將多克隆抗體做梯度稀釋，用間??接ＥＬＩＳＡ實(shí)驗(yàn)測定其效價(jià)，結(jié)果如圖２．２和表２．３。所制備的／ｆｌＷａ多克隆抗體化ＩＳＡ??效價(jià)高于１：３２０００。??ｋ?Ｉ＊?？?ｍｔｓ．?￡？?ｗ－ｆｒｉｉ?ｔＪｉｈ?．?４？ｒｖ＇ｍ?■??ｉ?霄帶＇’．紫Ａ?；?５??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１??Ｂｌａｎｋ?（－）?ＰＡ?ＰＡ?ＰＡ?ＰＡ??至：１０朋?ｍ㈱０?１；如㈱?１：３２０００?１?；１現(xiàn)０００??圖２．２多克隆抗體間接ＥＬＩＳＡ效價(jià)??Ｆｉｇ．?２．２?ＥＬＩＳＡ?ｌｉｔｒｅ?ｏｆ?ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ａｇａｉｎｓｔ?Ｅ．?ｔａｒｄａ．?Ｆｏｒｍａｌｉｎ?ｋｉｌｌｅｄ?ｗｈｏｌｅ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?￡．?ｔａｒｄａ?ａｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ打?ｏｆ?ｌｘｌ〇８?ＣＦＵ／ｍｌ?ｗｅｒｅ?ｃｏａｔｅｄ?ａｎｄ?ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ?ｉｎｄｉｒｅｃｔ?巨ＬＩＳＡ?ｕｓｉｎ呂?ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ａｔ??ｓｅｒｉａｌ?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｏｆ?１：１０００


本文編號(hào)：2911759