肌細胞增強因子2(Myocyte Enhancer Factor 2, MEF2)是MADS-Box轉錄調節(jié)因子超家族成員之一。在脊椎動物中,MEF2家族由A、B、C、D四種亞型組成,廣泛存在于平滑肌,骨骼肌和心肌等肌細胞中；是調控肌肉發(fā)生發(fā)育過程中關鍵的調節(jié)因子之一,可激活多種參與肌肉發(fā)生發(fā)育、肌肉組織再生等相關基因的表達。本試驗以黃鱔為實驗材料,克隆出黃鱔MEF2基因家族MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D四個成員的全序列,采用實時熒光定量PCR技術研究了黃鱔MEF2家族四基因胚后不同發(fā)育階段、成魚不同組織和黃鱔骨骼肌損傷再修復試驗中的表達變化規(guī)律。主要研究結果如下：采用常規(guī)RT-PCR和同源克隆等技術克隆獲得黃鱔MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D的ORF區(qū)序列,登錄號分別為：KM103279、KM103280、KM103281和KM103282。長度分別為1593bp、1419bp、1864bp和2412bp,分別編碼482,472,477和535個氨基酸。序列分析發(fā)現MEF2基因家族四個成員均具有MADS-box功能域和MEF2功能域。MEF2家族四基因在黃鱔胚后不同發(fā)育階段和成魚的不同組織中均有不同程度的表達。黃鱔MEF2基因家族在黃鱔5g-180g發(fā)育階段呈現有一定波動但整體上呈現上升的趨勢,其中MEF2C最為明顯。在不同組織中,MEF2基因家族四個成員在骨骼肌的表達量顯著高于其他組織(p0.05),其中MEF2A和MEF2D在骨骼肌中的表達量最高,心臟次之,其他組織表達量很低。MEF2B和MEF2C在骨骼肌中的表達量最高,其他組織表達量幾乎無差異,且表達量都很低。本研究通常骨骼肌損傷建模,采用冰凍切片技術觀察到骨骼肌損傷再修復的過程,通常實時熒光定量技術發(fā)現黃鱔MEF2基因家族在黃鱔骨骼肌損傷再修復過程中表現出先上升后下降最后恢復到損傷前表達水平。
【學位單位】：湖南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4;Q78
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 黃鱔的營養(yǎng)價值
    1.2 黃鱔的藥用價值
    1.3 黃鱔的研究進展
    1.4 肌細胞增強因子2基因家族（MEF2基因家族）研究進展
        1.4.1 MADS-box轉錄因子家族
        1.4.2 MEF2家族簡介
        1.4.3 MEF2的結構
        1.4.4 MEF2在肌肉發(fā)育中的調控作用
        1.4.5 MEF2因子在肌肉組織中的表達研究
        1.4.6 MEF2因子的組織表達研究
        1.4.7 MEF2A研究進展
        1.4.8 MEF2B研究進展
        1.4.9 MEF2C研究進展
        1.4.10 MEF2D研究進展
    1.5 損傷試驗建模
        1.5.1 麻醉劑
        1.5.2 損傷藥劑
        1.5.3 冰凍切片技術與SDH酶組化染色
    1.6 研究的目的和意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 取樣器材
        2.1.3 實驗取材
        2.1.4 實驗儀器與試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 總RNA提取
        2.2.2 RNA檢測
        2.2.3 總RNADnase處理
        2.2.4 感受態(tài)制備
        2.2.5 cDNA第一鏈合成
        2.2.6 引物設計
        2.2.7 MEF2A,MEF2B,MEF2C和MEF2D編碼區(qū)PCR擴增
        2.2.8 PCR擴增片段的回收與純化
        2.2.9 MEF2基因ORF區(qū)產物的連接和轉化
        2.2.10 挑克�。ㄋ{白斑陽性克隆篩選）和測序
        2.2.11 實時熒光定量PCR
        2.2.12 數據處理
        2.2.13 冰凍切片的制備SDH酶組化染色
        2.2.14 冰凍切片制備
        2.2.15 SDH酶組化染色流程
第三章 實驗結果與分析
    3.1 MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D克隆結果分析
        3.1.1 肌肉總RNA的電泳結果
        3.1.2 MEF2基因ORF區(qū)PCR克隆電泳結果
    3.2 黃鱔MEF2基因序列分析
    3.3 黃鱔MEF2基因家族氨基酸同源性比較與遺傳距離分析
    3.4 氨基酸序列比對和構建系統(tǒng)進化樹
    3.5 氨基酸含量比例
    3.6 黃鱔MEF2基因家族的時空表達結果分析
    3.7 黃鱔MEF2基因家族胚后不同發(fā)育階段表達情況
    3.8 黃鱔成魚MEF2基因家族不同組織表達情況
    3.9 損傷實驗MEF2基因家族表達情況及SDH酶染色結果
第四章 討論與分析
    4.1 黃鱔MEF2基因家族基因結構討論與分析
    4.2 黃鱔MEF2基因家族骨骼肌不同發(fā)育階段表達情況討論與分析
    4.3 黃鱔MEF2基因家族成魚不同組織表達情況討論與分析
    4.4 黃鱔MEF2基因家族損傷試驗中表達情況討論與分析
參考文獻
致謝
作者簡介

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本文編號：2883078