短蛸(Amphioctopus fangsiao)隸屬于頭足綱,是我國北部沿海最重要的經(jīng)濟(jì)種之一,由于市場需求和捕撈強(qiáng)度的增加使得自然資源日漸銳減。短蛸一般一年生,生命周期短,生長迅速,成為開展人工養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。本研究以短蛸為研究對象,成功構(gòu)建了短蛸均一化全長cDNA文庫,進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā);利用微衛(wèi)星親權(quán)鑒定技術(shù)研究了短蛸的交配模式,并對其性選擇機(jī)制進(jìn)行了探討,研究結(jié)果將為短蛸的人工繁育、增養(yǎng)殖及放流、種質(zhì)資源保護(hù)工作提供重要參考。一、短蛸cDNA文庫構(gòu)建、微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及引物通用性分析本研究構(gòu)建的cDNA文庫庫容為6.9×10~5個(gè)獨(dú)立克隆,重組率達(dá)到95%,插入片段的平均長度大于1000bp。通過篩選共獲得了3440條高質(zhì)量的ESTs,拼接得到1803個(gè)unigenes。其中450條(25%)unigenes在Gene Ontology系統(tǒng)下分為33類,通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫將576個(gè)(31.9%)unigenes歸入153個(gè)基因或可能參與的代謝途徑,275個(gè)(15.3%)unigenes歸為22個(gè)COG類別。從獲得的ESTs中開發(fā)了119個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記,每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)為1.343~13.954個(gè);觀測雜合度(Ho)為0.000~1.0000,平均觀測雜合度為0.575;期望雜合度(He)為0.260~0.902,平均期望雜合度為0.706;多態(tài)信息含量(PIC)為0.304~0.923。在所有位點(diǎn)中,高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC0.5)有109個(gè),中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.5PIC0.25)有10個(gè);連鎖不平衡檢測結(jié)果顯示,位點(diǎn)間無連鎖不平衡現(xiàn)象;經(jīng)Bonferroni校正后,有22個(gè)位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。此外,分析了43對引物在近緣種金烏賊(Sepia esculenta)、長蛸(Octopus minor)、真蛸(Octopus vulgaris)、卵蛸(Amphioctopus ovulum)、日本無針烏賊(Sepiella japonica)中的通用性情況,結(jié)果顯示在金烏賊、長蛸、真蛸、卵蛸和日本無針烏賊中分別有5個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、2個(gè)和1個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記成功擴(kuò)增,表明這些位點(diǎn)的通用性較低,近緣物種的微衛(wèi)星引物有待進(jìn)一步開發(fā)。本研究開發(fā)的短蛸微衛(wèi)星標(biāo)記將為其種群遺傳結(jié)構(gòu)研究提供重要工具,有助于其種質(zhì)資源保護(hù)與管理。二、短蛸微衛(wèi)星多重PCR體系的構(gòu)建及交配模式分析本研究選取12對高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)化組合,構(gòu)建了4組三重PCR體系,對短蛸4個(gè)母本、104個(gè)子代及19個(gè)候選父本進(jìn)行親權(quán)鑒定,分析其交配模式。結(jié)果表明,構(gòu)建的4組三重PCR體系可有效鑒定短蛸的親權(quán)關(guān)系,104個(gè)子代鑒定率為94.23%;♀1組樣品鑒定出12個(gè)子代,父本數(shù)為3個(gè),♀2組樣品鑒定出40個(gè)子代,父本數(shù)為7個(gè),♀3組樣品鑒定出19個(gè)子代,父本數(shù)為2個(gè),♀4組樣品鑒定出27個(gè)子代,父本數(shù)為4個(gè);并且父本♂2,♂3,♂7和♂10均與兩個(gè)以上的母本發(fā)生了交配,由此分析得出短蛸交配模式存在多雌多雄關(guān)系。多雌多雄交配模式是水產(chǎn)動(dòng)物對環(huán)境及人為捕撈壓力的一種適應(yīng),能有效提高等位基因遺傳多樣性以及子代遺傳變異類型,對穩(wěn)定其種群結(jié)構(gòu),提高繁殖效率和子代質(zhì)量起到積極作用。交配模式研究可為短蛸的人工繁育及種質(zhì)資源保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)資料。三、短蛸交配前后性選擇機(jī)制研究本研究首先選取36個(gè)成體短蛸進(jìn)行形態(tài)測量并分析11個(gè)形態(tài)參數(shù)的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)短蛸的胴長、胴寬、8個(gè)腕長與總重有顯著相關(guān)性。選取14個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對3個(gè)母本、176個(gè)子代及17個(gè)候選父本進(jìn)行親權(quán)鑒定,證明短蛸存在多雌多雄交配模式。對有子代和無子代父本的形態(tài)參數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn),未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P0.05),表明短蛸雌性個(gè)體在交配前未對雄性交配對象的外部特征進(jìn)行選擇。對后代比例高的父本與后代比例低的父本的形態(tài)參數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)父權(quán)比例與父本的形態(tài)大小參數(shù)無關(guān);對后代比例高和后代比例低的父本與母本的遺傳相似性進(jìn)行計(jì)算,發(fā)現(xiàn)父權(quán)比例與父母本遺傳相似性有關(guān)聯(lián)性,父母本遺傳相似性越高,后代比例越高。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

與 NCBI 非冗余蛋白質(zhì) Nr 數(shù)據(jù)庫或 COG（蛋白質(zhì)）數(shù)據(jù)庫比對來預(yù)測編碼蛋白的序列，比對標(biāo)準(zhǔn)可以設(shè)定為 1e2 Go 軟件在 Gene Ontology 系統(tǒng)下對獲得的序列作功能注釋[100]。A，mRNA，cDNA 文庫的質(zhì)量評估總 RNA 和 mRNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 2-1。圖 2-1A 顯8S rRNA 的目的條帶清晰，說明總 RNA 完整性很好。圖 2-1B 顯NA 呈彌散狀分布，其片段大小在 650bp 到 4000 bp，說明 mRN于后續(xù) cDNA 文庫的構(gòu)建。插入片段部分電泳結(jié)果如圖 2 所示拖尾，片段大小在 1000bp 以上。根據(jù) Clareke-Carbon 公式計(jì)算少含有 1.7×105個(gè)克隆[101]。重組率達(dá) 80%以上才算文庫構(gòu)建成 cDNA 文庫庫容為 6.9×105個(gè)獨(dú)立克隆，重組率達(dá)到 95%（38均一化全長 cDNA 文庫質(zhì)量良好，可用于后續(xù)的測序分析。

圖 2-2 短蛸 cDNA 文庫插入片段的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果M，分子標(biāo)記；1-16，插入片段。Fig. 2-2 PCR detection of the inserts of A. fangsiao cDNAlibrary.M, molecular marker; 1–16, inserts. 基因片段的整合與功能注釋通過篩選獲得了 3440 條 ESTs，拼接得到 1803 個(gè) unigenes，長度分布如圖，其平均長度為 688bp。這些 unigenes 中有 1622 條（占總 unigenes 的 90%到開放閱讀框，平均長度為 359bp；與 NCBI 非冗余蛋白質(zhì) Nr 數(shù)據(jù)庫ss-Port 蛋白數(shù)據(jù)庫比對分別有 684 條 (37.9%)，508 條 (28.2%)unigenes 與公列有較高的同源性。使用 Blast N 和 Blast X 兩個(gè)程序在 GO（Gene Ontology）系統(tǒng)上對聚類的 E注釋，注釋到 450 條（25%）unigenes 歸入 3 個(gè)本體（圖 2-4）。在 GO 系細(xì)胞成分、分子功能和生物學(xué)過程三類，三大本體中分別有 721 條（占 38.1% 條（34.6%）和 518 條（27.3%）已公布的序列。根據(jù)構(gòu)成的細(xì)胞成分，短蛸織的 unigenes 可分為 8 類，其中細(xì)胞和細(xì)胞組成部分?jǐn)?shù)量最多(194, 29.6%

圖 2-3 拼接片段 unigenes 的長度分布圖Fig. 2-3 Length distribution of unigenes.O（Gene Ontology）系統(tǒng)上功能注釋結(jié)果：450 個(gè) unigen體：生物過程, 細(xì)胞組分和分子功能
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2882233