嗜水氣單胞菌是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的一種主要病原菌,對(duì)全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害和經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)亦可感染人類,對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅,是—種典型的人-魚共患致病菌。深入研究嗜水氣單胞菌的毒力調(diào)控機(jī)制對(duì)于其引發(fā)的病害防治具有重要意義。Hfq是一種廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)的sRNA分子伴侶蛋白,可促進(jìn)不同sRNA分子與其靶標(biāo)mRNA分子間的相互作用,作為轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控因子參與細(xì)菌的多種生理進(jìn)程,并對(duì)多種病原菌的毒力具有重要的調(diào)控作用。本論文從山東煙臺(tái)養(yǎng)殖魚場(chǎng)發(fā)病石斑魚體內(nèi)分離得到一株優(yōu)勢(shì)毒力菌株,通過生理生化及分子生物學(xué)手段鑒定為嗜水氣單胞菌,以該菌株為研究對(duì)象,克隆得到其hfq基因序列,利用無標(biāo)記基因缺失手段成功構(gòu)建獲得△hfq突變株,并進(jìn)一步研究了Hfq對(duì)嗜水氣單胞菌不同生理功能及毒力的調(diào)控作用,為豐富人們對(duì)嗜水氣單胞菌毒力調(diào)控機(jī)制及其科學(xué)防治提供理論依據(jù)。本論文的研究結(jié)果如下：(1)從養(yǎng)殖魚場(chǎng)發(fā)病的石斑魚胰腺組織中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株,通過對(duì)其生長(zhǎng)特性、生理生化特性等研究,發(fā)現(xiàn)分離菌株為革蘭氏陰性短桿菌,可形成β溶血圈：能夠發(fā)酵利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、還原硝酸鹽、分解利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖等,不能分解枸櫞酸鹽、木糖、肌醇等；對(duì)頭孢曲松、磷霉素、等四種極度敏感,對(duì)青霉素、氨芐西林等六種不敏感。進(jìn)一步通過16S rRNA序列克隆比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn),該菌和其他已知的嗜水氣單胞菌16S rRNA基因序列同源性高達(dá)99%以上,并且在進(jìn)化樹上處于同一個(gè)分支上,結(jié)合生理生化特性確定為嗜水氣單胞菌,人工回歸感染試驗(yàn)表明分離到的嗜水氣單胞菌具有致病性。(2)對(duì)嗜水氣單胞菌hfq基因進(jìn)行了克隆,得到264 bp大小的特異性片段,編碼88個(gè)氨基酸。Hfq蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含1個(gè)由12個(gè)氨基酸組成α-螺旋區(qū)(H)和32個(gè)氨基酸組成的5個(gè)β-折疊區(qū)(E),其他區(qū)域均為無規(guī)則卷曲區(qū)(-)。Hfq蛋白三維空間結(jié)構(gòu)是一個(gè)中空環(huán)狀的六聚體。成功構(gòu)建了Hfq重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-hfq,通過誘導(dǎo)表達(dá)成功檢測(cè)到一條大小約為12 kDa的特異性蛋白條帶,且其表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。(3)利用自殺質(zhì)粒pDM4,通過同源重組的方法成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌的無標(biāo)記hfq基因框內(nèi)缺失突變株△hfq。通過對(duì)野生型和△hfq突變株不同表型測(cè)定發(fā)現(xiàn),在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi),△hfq突變株的生長(zhǎng)相對(duì)于野生型有所下降；在進(jìn)入穩(wěn)定期后,△hfq突變株的生長(zhǎng)達(dá)到與野生型相當(dāng)?shù)乃?并在后期略微有所提高。Hfq對(duì)游動(dòng)性具有正調(diào)控作用,對(duì)泳動(dòng)性和溶血活性調(diào)控不明顯；當(dāng)Hfq表達(dá)受損時(shí),其胞外蛋白酶產(chǎn)量顯著提高,即Hfq對(duì)嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)量具有明顯的抑制作用；此外,hfq基因缺失后,嗜水氣單胞菌在30%蔗糖和3%NaCl條件下的生長(zhǎng)受到顯著抑制；在不同SDS和乙醇濃度下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),△hfq突變株的生長(zhǎng)亦受到一定程度的影響。以斑馬魚為模型進(jìn)行了嗜水氣單胞菌感染實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株具有明顯的毒力,當(dāng)Hfq表達(dá)受損時(shí),嗜水氣單胞菌對(duì)斑馬魚的毒力顯著下降。
【學(xué)位單位】：陜西科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S941.4
【部分圖文】：

圖２－１分萬菌株電子顯微鏡形態(tài)??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏ打?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｉｓｏｌａ化ｄ?ｓｔｒａｉｎ??圓??圖２－２分離菌襪溶血活性檢測(cè)??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?化ｅ?ｉｓｏｌａ化ｄ?ｓｔｒｉａ打??２．３．２分離苗生理生化特性檢測(cè)??對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定，結(jié)果顯示分離菌株能夠發(fā)酵利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、??能夠還原硝酸鹽、分解利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、庶糖等，不能分解構(gòu)嫁酸鹽、木??糖、肌醇等（表２－２）。??１４??

ｆ?乂方猜．４、？娘Ｊ??Ｋ，ｔ、＞心人，．心與＊．如、巧－??重、氣式＇戶這Ｔ?：＞Ｖ．《－戶若？禾??畔齊滿愈??茲巧讀；為＾則??圖２－１分萬菌株電子顯微鏡形態(tài)??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏ打?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｉｓｏｌａ化ｄ?ｓｔｒａｉｎ??圓??圖２－２分離菌襪溶血活性檢測(cè)??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?化ｅ?ｉｓｏｌａ化ｄ?ｓｔｒｉａ打??２．３．２分離苗生理生化特性檢測(cè)??對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定，結(jié)果顯示分離菌株能夠發(fā)酵利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、??能夠還原硝酸鹽、分解利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、庶糖等，不能分解構(gòu)嫁酸鹽、木??糖、肌醇等（表２－２）。??１４??

結(jié)果顯示其由１４３２個(gè)堿基所組成。利用ＮＣＢＩ?ＢＬＡＳＴ將所得序列與該數(shù)據(jù)庫(kù)??中己公布的其它細(xì)菌的１６Ｓ?ｒＲＮＡ進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示該序列與其他幾個(gè)嗜??水氣單胞菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列同源性高達(dá)９９％Ｌ：ＪＪｉ（圖２－３）。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)分離菌??株１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因序列與ＧｅｎＢａｎｋ己登錄的其它嗜水氣單胞菌１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因序列建立??系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖２－４），結(jié)果顯示分離菌株與嗜水氣單胞菌在同一個(gè)分支上，結(jié)合前面的??生理生化結(jié)果和形態(tài)特征確定菌株為嗜水氣單胞菌。??Ｃｏｌｏｒ?ｋｅｙ?ｆｏｒ?ａｌｉｇｎｍｅｎｔ?ｓｃｏｒｅｓ?ＳＥｆｒｏｊｎｔｏｇｉｇｔｉｔ＃＊??—ｍ■遐□—ａ心柳．．．?？???—??????Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?化?Ｔｇ?沁，Ｅ??１?２５０?５００?７５０?１０００?１２５０?＾?＾??Ｚ?＊了＇了藝＾＾？３＞＾３？＂＂?ａｉ？?Ｍｉｗ?巧抓＊?說?Ｈ?巧師?＊做??￣?公歷＂＾．＂＊＊＂＊＊?巧獅化?ｗ?病巧視？，??－仰子並?ＷＷｉｉＨＰ?町巧種巧戸ＵＭｆｌｗｇ?扣苗？化（．０?巧?Ｋｆｔｌｉｇ，??三?＆?巧巧化田巧�。荆蓿浚保荆福福�？９０?巧肛化＂巧?＞Ｃｇｌ０ＩＣ，??￣?？＾巧巧ＭｒａｆｉＢｓａｎ?議５?巧＊ＭｆｆｌｔｉｉｇａａａｊＫｔｔｔＭａＭｔｔ?故肪化?Ｍ?９％??￣?ＷＴ左衍病做晰巧飯ｇａＷａｎｔｃＯＴ獻(xiàn)巧《〇?巧?Ｓ？?ＫＲ?Ｍ?巧度的Ｗ！??Ｚ?＃Ｔ？本ｇ。ＳＷ?巧?ＷＳｙａＲＷ化鄉(xiāng)巧巧）Ｋ?Ｍ仍ａｍ?＇．??ｒ?巧巧逆巧ｙｔｓｓｏｎ。
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本文編號(hào)：2882176