嗜水氣單胞菌(Aeromona hydrophila)是一種典型的人-魚-獸共患病的條件致病菌,可引發(fā)魚類患出血性敗血癥。每年由于該菌導致的流行性疾病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,嚴重阻礙著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在養(yǎng)殖業(yè)中,針對該菌引發(fā)的疾病,常見的防治措施是抗生素防治,導致細菌的耐藥性日益增強。近年來由于疫苗相關技術的快速發(fā)展,以及其高效的抑菌或殺菌效果,使之正成為替換抗生素的重要防治措施之一。但是當前疫苗的種類并不多,制約著疫苗的廣泛使用。因此,尋找具有免疫原性的保護蛋白,開發(fā)新型疫苗,對防治該菌引發(fā)的疾病以及抑制其耐藥性的蔓延具有重要的現(xiàn)實意義。以往文獻報道,細菌的外膜蛋白組分可作為魚類疫苗的候選蛋白,但多集中在對體外營養(yǎng)富集培養(yǎng)基中表達量較高的少數(shù)幾個外膜蛋白的研究上,對自然條件下表達的外膜蛋白免疫保護性質(zhì)研究較為缺乏。而細菌在入侵宿主時,往往處于局部缺鐵的環(huán)境中,細菌表達特定外膜蛋白并在與宿主競爭鐵離子或者參與細胞內(nèi)部鐵離子平衡中起重要的生物學功能。對這些相關外膜蛋白在缺鐵環(huán)境中的表達及免疫保護特性的研究,有望成為候選蛋白,為當前新型疫苗的開發(fā)提供有效候選抗原。本研究利用定量蛋白質(zhì)組學和分子生物學方法,模擬自然條件下的缺鐵環(huán)境,分析嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)在正常和缺鐵培養(yǎng)基中外膜蛋白的變化差異。采用TMT標記與質(zhì)譜聯(lián)用的方法比較兩種狀態(tài)下的月桂酰肌氨酸鈉不溶性蛋白組分,共鑒定到682個蛋白,發(fā)現(xiàn)有174個表達差異蛋白,其中91個上調(diào)表達和83個下調(diào)表達,并分別包含21個和10個外膜蛋白。結合生物信息學分析發(fā)現(xiàn),下調(diào)蛋白中多數(shù)是核糖體蛋白,其主要功能是參與RNA聚合;而上調(diào)蛋白主要是鐵載體受體蛋白、鐵色素載體受體、血紅素受體等外膜蛋白以及一些參與抗生素和次生代謝產(chǎn)物合成的蛋白。為驗證外膜蛋白在鐵離子限制條件下的變化,本論文運用分子生物學技術對AHA_0972(A0KGW8)、AHA_427(A0KQZ1)、AHA3963(A0KQ46)、AHA_0461(A0KFG8)和AHA_1663(A0KIU8)等五個外膜蛋白的相應基因進行體外PCR擴增,利用pET-32a原核表達載體構建相應的重組質(zhì)粒,成功克隆并獲得了高表達菌株。將上述蛋白高表達并純化,免疫小鼠獲得相應的抗體,經(jīng)檢測其效價均達到1:8000以上。Western Blotting分析發(fā)現(xiàn),在嗜水氣單胞菌ATCC 7966及強毒株LP-1中,以上五個外膜蛋白在正常培養(yǎng)基下為低豐度蛋白,而在缺鐵條件下表達水平顯著增加,與質(zhì)譜分析的結果一致,提示它們可能在鐵離子動態(tài)平衡中起著重要作用。最后,為檢驗鐵離子相關外膜蛋白對魚類是否具有免疫保護性,本論文首先提取嗜水氣單胞菌ATCC 7966和LP-1正常和缺鐵狀態(tài)下的外膜蛋白分別免疫斑馬魚,并選用嗜水氣單胞菌魚源強毒株LP-1進行攻毒實驗,以BSA+佐劑為對照,結果表明免疫嗜水氣單胞菌ATCC 7966正常和缺鐵狀態(tài)下外膜蛋白的斑馬魚生存率分別為60%和63.3%,相對免疫保護率分別為53.8%和57.6%;免疫嗜水氣單胞菌LP-1相同處理下的外膜蛋白的生存率分別為63.3%和66.6%,相對免疫保護率分別為57.6%和61.5%;對照組(BSA+佐劑)最終生存率為13.33%,提示缺鐵狀態(tài)下的外膜蛋白組分免疫保護性比正常狀態(tài)下高。另外,進一步對 A0KGW8、A0KQ46、A0KQZ1、A0KIU8和A0KFG8這五個鐵載體受體外膜相關蛋白進行免疫評價。將這些蛋白進行高表達并純化,對斑馬魚進行免疫,然后利用嗜水氣單胞菌LP-1強毒株進行攻毒,其生存率分別為46.7%、63.3%、63.3%、73.3%和66.7%,而對照組(BSA+佐劑)為16.7%;相對免疫保護率分別為36%、56%、56%、68%和60%。上述結果表明,除A0KGW8效果較弱以外,其他四個蛋白都具備良好的免疫保護性,可作為嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的候選蛋白,同時提示利用定量蛋白質(zhì)組學方法尋找潛在免疫保護性抗原是篩選魚類候選疫苗有效的策略之一。
【學位單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S941.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖及病原菌爆發(fā)狀況
    2 水產(chǎn)養(yǎng)殖病原微生物治療與防治措施
        2.1 抗生素
            2.1.1 抗生素的濫用
            2.1.2 抗生素的濫用的危害
        2.2 漁藥抗生素與耐藥性
        2.3 疫苗的相關研究
            2.3.1 疫苗的出現(xiàn)
            2.3.2 疫苗的發(fā)展時期
            2.3.3 現(xiàn)代疫苗發(fā)展時期
        2.4 魚類疫苗的種類與研究進展
            2.4.1 傳統(tǒng)疫苗
            2.4.2 新型疫苗
        2.5 當前魚用疫苗研發(fā)的困難與瓶頸
    3 嗜水氣單胞菌的危害與疫苗防治措施
        3.1 嗜水氣單胞菌危害
        3.2 嗜水氣單胞疫苗研究
            3.2.1 嗜水氣單胞菌傳統(tǒng)疫苗研究
            3.2.2 外膜蛋白亞單位疫苗
        3.3 鐵載體相關免疫
    4 本論文主要研究內(nèi)容及其生物學意義
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 生物材料
            1.1.1 實驗用菌種
            1.1.2 實驗用鼠
            1.1.3 模式生物斑馬魚
            1.1.4 載體
        1.2 試劑材料與來源
        1.3 實驗設備
        1.4 試劑的配置
            1.4.1 月桂酰肌氨酸鈉不溶性蛋白提取和質(zhì)譜分析試劑配制
            1.4.2 分子生物學相關試劑配制
            1.4.3 細菌培養(yǎng)相關試劑配制
            1.4.4 SDS-PAGE電泳緩沖液試劑配制
            1.4.5 抗體效價檢測相關試劑配制
            1.4.6 蛋白純化相關試劑配制
    2 實驗方法
        2.1 細菌培養(yǎng)
        2.2 月桂酰肌氨酸鈉不溶性蛋白的提取
        2.3 蛋白濃度測定
        2.4 蛋白酶解
        2.5 肽段標記
        2.6 LC-Orbitrap質(zhì)譜鑒定
        2.7 蛋白膠內(nèi)酶解
        2.8 LC-LTQ XL質(zhì)譜檢測
        2.9 生物信息學數(shù)據(jù)分析
        2.10 分子生物學相關實驗方法
            2.10.1 PCR
            2.10.2 質(zhì)粒提取
            2.10.3 核酸產(chǎn)物純化
            2.10.4 限制性內(nèi)切酶酶切
            2.10.5 連接轉(zhuǎn)化
            2.10.6 菌液PCR
        2.11 包涵體蛋白純化實驗方法
            2.11.1 包涵體蛋白純化
            2.11.2 復性
        2.12 Western blotting
        2.13 ELISA測定小鼠血清效價
        2.14 斑馬魚和小鼠的養(yǎng)殖
            2.14.1 斑馬魚
            2.14.2 實驗小白鼠
        2.15 小鼠血清獲取與斑馬魚免疫
            2.15.1 小鼠血清獲取
            2.15.2 斑馬魚半數(shù)致死量測定
            2.15.3 斑馬魚蛋白免疫
            2.15.4 斑馬魚攻毒
第三章 嗜水氣單胞菌鐵離子限制下差異外膜蛋白組學研究
    第一節(jié) 正常和缺鐵狀態(tài)下外膜蛋白質(zhì)組學比較
        1 引言
        2 結果
            2.1 正常和缺鐵狀態(tài)下月桂酰肌氨酸鈉不溶性蛋白的提取
            2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
            2.3 月桂酰肌氨酸鈉不溶組分蛋白質(zhì)譜檢測
            2.4 差異蛋白生物信息學分析
                2.4.1 差異蛋白Domain分析
                2.4.2 差異蛋白GO與KEGG分析
            2.5 基因功能注釋分析
            2.6 差異蛋白之間的相互作用分析
        3 小結
    第二節(jié) 正常和缺鐵狀態(tài)下OMPs差異蛋白驗證
        1 引言
        2 原核表達載體構建
            2.1 引物設計
            2.2 原核表達載體構建
        3 蛋白純化與抗體制備
        4 LC-LTQ XL質(zhì)譜鑒定
        5 Western blotting分析
        6 斑馬魚免疫實驗
            6.1 半數(shù)致死量測定
            6.2 外膜蛋白組分免疫保護性實驗
            6.3 鐵載體受體相關蛋白免疫保護性實驗
        7 討論
總結與展望
參考文獻
碩士研究生期間發(fā)表的論文
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張祥民;;色譜-質(zhì)譜技術在生物分析研究中的最新進展[J];色譜;2017年01期

2 楊云;劉紅昌;夏金蘭;馬亞龍;聶珍媛;;極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及應用[J];生物技術通報;2016年11期

3 程瑩;;疫苗的發(fā)展與現(xiàn)狀[J];人人健康;2016年20期

4 陳飛;周彤;魏宇佳;楊晶;戴傳超;;茅蒼術質(zhì)膜蛋白的制備及其雙向電泳蛋白質(zhì)組學平臺的構建[J];生物技術通報;2016年09期

5 陳亨利;莫金龍;康元環(huán);陳龍;畢建飛;張冬星;李芳芳;李影;單曉楓;;維氏氣單胞菌滅活疫苗的制備及對錦鯉免疫效果評價[J];中國獸醫(yī)雜志;2016年05期

6 王麗麗;田靜;;濫用抗生素的危害及預防策略[J];生物技術世界;2016年03期

7 張鵬云;劉馬峰;程安春;;細菌鐵離子利用系統(tǒng)與宿主抗感染免疫[J];生命科學研究;2016年01期

8 董雪紅;田敏;季策;馬文元;張慶華;;兩種LD_(50)計算方法對副溶血性弧菌毒力的比較研究[J];上海海洋大學學報;2016年01期

9 稅蕓;劉馬峰;程安春;;細菌血紅素降解蛋白結構特點及作用機制[J];中國生物化學與分子生物學報;2015年08期

10 李振;張建城;曹振輝;王熙濤;王麗麗;李曉宇;徐永平;李淑英;;噬菌體控制主要水產(chǎn)養(yǎng)殖類致病菌的研究進展[J];畜牧與獸醫(yī);2015年08期

相關碩士學位論文 前1條

1 閆雪鋒;副豬嗜血桿菌hxuCBA基因簇克隆表達及其免疫特性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

本文編號：2874509