異育銀鯽是我國(guó)重要的鯽魚養(yǎng)殖品種,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,各類病害接踵而至,病害問(wèn)題已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素,尤其是粘孢子蟲病,嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的苗種培育和成魚養(yǎng)殖。其中,武漢單極蟲、洪湖碘泡蟲、吳李碘泡蟲及丑陋圓形碘泡蟲對(duì)異育銀鯽的危害最為嚴(yán)重,不僅影響宿主的生長(zhǎng)發(fā)育,使商品魚失去應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,嚴(yán)重時(shí)甚至引起感染魚的大量死亡。為有效控制粘孢子蟲病害,亟需建立異育銀鯽重要寄生粘孢子蟲的快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)方法。因此,本研究以這4種粘孢子蟲為研究對(duì)象,建立單輪PCR與多重PCR檢測(cè)方法,以期為粘孢子蟲病的快速診斷與防治提供技術(shù)支持。1.4種粘孢子蟲單輪PCR檢測(cè)方法的建立:分別以武漢單極蟲的28S rDNA、洪湖碘泡蟲與吳李碘泡蟲的ITS-5.8S rDNA、丑陋圓形碘泡蟲的18S r DNA基因?yàn)榉肿影袠?biāo),各篩選一對(duì)特異性引物,特異性產(chǎn)物大小依次為245bp、447bp、590bp、894bp。試驗(yàn)證明4對(duì)引物的特異性與通用性良好,無(wú)非特異性擴(kuò)增干擾,對(duì)非目的粘孢子蟲無(wú)交叉反應(yīng)。靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示,四種單輪PCR方法的檢測(cè)靈敏性均達(dá)到了pg級(jí)水平。2.4種粘孢子蟲多重PCR檢測(cè)方法的建立:在上述建立的單輪PCR基礎(chǔ)上,將4對(duì)引物置于同一個(gè)PCR體系,通過(guò)反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化,成功在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增出4條目的條帶,且能明顯區(qū)分,無(wú)非特異性擴(kuò)增干擾。靈敏性試驗(yàn)顯示,建立的多重PCR方法對(duì)四種粘孢子蟲的檢測(cè)靈敏性均達(dá)到了ng級(jí)水平。3.兩種PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用:將兩種方法初步應(yīng)用于104份異育銀鯽混合組織DNA樣品檢測(cè),并與顯微鏡檢測(cè)相比較,結(jié)果顯示,兩種PCR方法的陽(yáng)性檢出率均高于顯微鏡檢測(cè),而單輪PCR方法的陽(yáng)性檢出率高于多重PCR方法。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S943
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 異育銀鯽粘孢子蟲病
        1.1 洪湖碘泡蟲病
        1.2 武漢單極蟲病
        1.3 吳李碘泡蟲病
        1.4 丑陋圓形碘泡蟲病
    2 粘孢子蟲檢測(cè)技術(shù)
        2.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)
        2.2 免疫學(xué)檢測(cè)
        2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)
    3 分子檢測(cè)靶基因
    4 本研究的目的及意義
第二章 四種粘孢子蟲單輪PCR檢測(cè)方法的建立
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 樣品采集與保存
        1.2 試劑與試劑盒
        1.3 儀器與設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 粘孢子蟲DNA的提取、PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序
        2.2 靶基因選擇及引物設(shè)計(jì)
        2.3 單輪PCR方法的建立
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.1 單輪PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2 單輪PCR特異性結(jié)果
        3.3 單輪PCR靈敏性結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 四種粘孢子蟲多重PCR檢測(cè)方法的建立
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 樣品采集與保存
        1.2 試劑與試劑盒
        1.3 儀器與設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序
        2.2 多重PCR方法的建立
    3 結(jié)果與分析
        3.1 多重PCR擴(kuò)增與優(yōu)化結(jié)果
            3.1.1 退火溫度的優(yōu)化
            3.1.2 引物濃度優(yōu)化
2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶平衡濃度優(yōu)化'>            3.1.3 Mg²⁺、dNTPs、TaqDNA聚合酶平衡濃度優(yōu)化
            3.1.4 多重PCR優(yōu)化結(jié)果
        3.2 多重PCR特異性結(jié)果
        3.3 多重PCR靈敏性結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第四章 兩種PCR方法的應(yīng)用與比較
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 樣品采集
        1.2 試劑與試劑盒
        1.3 儀器與設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 顯微鏡檢測(cè)
        2.2 樣品總DNA提取
        2.3 單輪PCR方法應(yīng)用
        2.4 多重PCR方法應(yīng)用
    3 檢測(cè)結(jié)果與分析
        3.1 顯微鏡檢測(cè)結(jié)果
        3.2 單輪PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.3 多重PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.4 檢測(cè)結(jié)果的比較
    4 討論
    5 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

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