卡拉膠作為一種安全的食品添加劑,具有凝膠、增稠和保水特性,是食品加工行業(yè)的重要原料。熱帶海域生長(zhǎng)繁殖的大型藻類——長(zhǎng)心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、異枝卡帕藻(Kappaphycus striatum)和細(xì)齒麒麟菜(Eucheuma denticulatum)是重要的產(chǎn)卡拉膠海藻,具有極高應(yīng)用與經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。本研究以上述海藻為對(duì)象,1)探討了長(zhǎng)心卡帕藻原生質(zhì)體分離方法,研究纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶等破壁酶對(duì)藻細(xì)胞的破壁效果,隨后利用融合劑——聚乙二醇(PEG-4000)進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)進(jìn)而成功地實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體融合;2)利用不同配比的植物生長(zhǎng)調(diào)劑(植物生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等)、光強(qiáng)梯度以及不同PES培養(yǎng)基類型(固體和液體),通過長(zhǎng)心卡帕藻組織培養(yǎng),研究并優(yōu)化了該藻新芽形成和愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生的條件;顯微跟蹤觀察了該藻愈傷組織形態(tài)建成過程,同時(shí),探究了愈傷組織形態(tài)建成和新芽形成過程中其光合與呼吸發(fā)生的變化;3)以26°C為對(duì)照溫度,研究了在系列梯度低溫(23°C、20°C、17°C和14°C)和高溫(29°C、32°C和35°C)下,長(zhǎng)心卡帕藻、異枝卡帕藻和細(xì)齒麒麟菜(紅色和綠色藻株)的各種抗氧化物酶(SOD、GPX、APX、CAT、POD等)酶活性和抗氧化相關(guān)物質(zhì)(H2O2、GSH、GSSG、MDA等)含量變化,并探討了其抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制;分析測(cè)定了溫度脅迫下,上述海藻的光合與呼吸速率,光化學(xué)效率,PSII天線端、反應(yīng)中心、電子供體側(cè)、電子受體側(cè)等光系統(tǒng)關(guān)鍵部位的變化;比較研究了兩種卡帕藻,紅、綠兩株細(xì)齒麒麟菜對(duì)低溫(或高溫)耐受性的差異。獲得的主要結(jié)果如下:1、成功獲得了長(zhǎng)心卡帕藻原生質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)蝸牛酶比纖維素酶和果膠酶有更高的細(xì)胞破壁效率。但該藻原生質(zhì)體產(chǎn)率相對(duì)較低,原生質(zhì)體濃度可維持在103-104個(gè)/mL,尚難達(dá)到細(xì)胞融合所需的106-107個(gè)/mL細(xì)胞濃度。經(jīng)過初步離心濃縮,原生質(zhì)體濃度可達(dá)到105個(gè)/mL,隨后用PEG-4000化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞融合,可成功觀察到原生質(zhì)體融合現(xiàn)象,但總體融合效率尚有待進(jìn)一步提高。2、在長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織誘導(dǎo)過程中,發(fā)現(xiàn)適宜的添加蔗糖、6-BA,使用固體培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)具有重要作用,其中用“0.5 g/L蔗糖、光強(qiáng)54μmol/m-2·s-1、PES固體培養(yǎng)基(0.8%瓊脂)、2 mg/L 6-BA、未加植物生長(zhǎng)素”的組合能夠更有效地誘導(dǎo)該藻愈傷組織形成;該藻愈傷組織為瘤狀的致密細(xì)胞團(tuán),由不含色素的細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞組成;通過跟蹤顯微觀察該藻愈傷組織形態(tài)建成過程,發(fā)現(xiàn)其來源于藻髓部小細(xì)胞,同時(shí)發(fā)現(xiàn)形成愈傷組織的藻枝段比形成新芽的藻枝段有較高的光合和呼吸速率,表明產(chǎn)生愈傷組織時(shí)的藻枝段細(xì)胞會(huì)有較高的生理活動(dòng)與代謝。3.(1)在輕度低溫(20°C和23°C)或高溫(29°C和32°C)脅迫下,卡帕藻和麒麟菜通過提高抗氧化系統(tǒng)SOD、POD、APX、GPX等幾種重要抗氧化物酶的活性、羥自由基去除能力和抗氧化物質(zhì)GSH的含量以適應(yīng)溫度脅迫,但是在重度低溫(14°C)或高溫(35°C)下,上述抗氧化酶活性下降、抗氧化物質(zhì)含量降低,藻體抗氧化系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷,藻機(jī)體不能抵御上述脅迫。(2)長(zhǎng)心卡帕藻光系統(tǒng)能耐受20°C和23°C低溫,異枝卡帕藻僅能耐受23°C低溫,但溫度在20°C以下時(shí)兩者皆不能忍受,表明長(zhǎng)心卡帕藻比異枝卡帕藻有較強(qiáng)的低溫耐受性。相比而言,在適度低溫20°C和23°C時(shí),綠色細(xì)齒麒麟菜光系統(tǒng)效率有所降低,而紅色細(xì)齒麒麟菜卻未受影響,推測(cè)細(xì)齒麒麟菜的紅色藻株比綠色藻株有更強(qiáng)的低溫耐受性。(3)上述藻的PSII天線端、反應(yīng)中心和電子受體側(cè)對(duì)低溫敏感性不同:長(zhǎng)心卡帕藻PSII天線端比反應(yīng)中心和電子受體側(cè)對(duì)低溫敏感,異枝卡帕藻PSII天線端和反應(yīng)中心比電子受體側(cè)對(duì)低溫敏感;紅色細(xì)齒麒麟菜PSII天線端比反應(yīng)中心和電子受體側(cè)對(duì)低溫敏感,綠色細(xì)齒麒麟菜PSII反應(yīng)中心和電子受體側(cè)比天線端對(duì)低溫敏感。(4)最新發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下長(zhǎng)心卡帕藻光系統(tǒng)一種可能的受傷機(jī)理:低溫脅迫通過降低Rubisco LSU的表達(dá)量影響光系統(tǒng)暗反應(yīng)的卡爾文循環(huán)(Calvin cycle),使得還原力(如NADPH)增多,光合電子傳遞鏈中存在過多剩余電子,從而引起ROS增多。ROS反過來進(jìn)一步影響基因psbA的翻譯,導(dǎo)致D1蛋白前體合成受阻,D1蛋白表達(dá)量減少,直接造成PSII修復(fù)過程無法完成。正常情況下,PSII損傷和PSII修復(fù)過程處于動(dòng)態(tài)平衡,而PSII修復(fù)過程無法進(jìn)行,使得PSII的損傷加重,導(dǎo)致了光系統(tǒng)損傷。(5)雖然長(zhǎng)心卡帕藻和異枝卡帕藻光系統(tǒng)都能耐受29°C和32°C高溫,但長(zhǎng)心卡帕藻在35°C下光系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞,而異枝卡帕藻光系統(tǒng)卻未出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷,推測(cè)異枝卡帕藻比長(zhǎng)心卡帕藻有較強(qiáng)的高溫耐受性。另外,高溫29°C和32°C使得紅色和綠色兩株細(xì)齒麒麟菜光合效率都有所增加,說明適度高溫可提高藻光合效率;但35°C高溫會(huì)導(dǎo)致紅色細(xì)齒麒麟菜光合系統(tǒng)受損傷,相比而言,綠色細(xì)齒麒麟菜能忍受35°C高溫,表明綠色細(xì)齒麒麟菜比紅色細(xì)齒麒麟菜有較強(qiáng)的高溫忍耐性。(6)長(zhǎng)心卡帕藻PSII天線端、反應(yīng)中心和電子受體側(cè)能承受29°C和32°C的高溫,但在35°C高溫時(shí)上述光合部位受到嚴(yán)重?fù)p傷,而異枝卡帕藻的PSII天線端的光吸收效率、反應(yīng)中心效率和電子受體接受電子效率在所有梯度高溫下都未有顯著性下降,再次證明異枝卡帕藻比長(zhǎng)心卡帕藻有較強(qiáng)的高溫耐受性;在35°C高溫下,紅色細(xì)齒麒麟菜反應(yīng)中心效率未受顯著影響,但天線端光吸收效率和電子受體接受電子效率降低,也說明不同光系統(tǒng)部位對(duì)高溫忍耐性不同。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.3
【部分圖文】：

圖 2-1 原生質(zhì)體分離所用的長(zhǎng)心卡帕藻（棕色）Figure 2-1 Kappaphycus alvarezii (brown) for protoplast isolation試劑和儀器與溶液液：氫鈉（NaH2PO4）貯液（A 液）：取 2.760g 磷酸二氫鈉于 100餾水使其溶解，然后轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水沖洗燒水全部轉(zhuǎn)入容量瓶中，搖勻后加蒸餾水定容至 100 mL。二鈉（Na2HPO4）貯液（B 液）：取 14.200g 磷酸氫二鈉于 1

體培養(yǎng)基洗滌 l-2次，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果（加入 PEG-4000融合液后，原生質(zhì)體只發(fā)生粘連，在洗滌過程中才發(fā)生細(xì)胞膜融合），注意區(qū)分細(xì)胞融合與細(xì)胞重疊。計(jì)算融合率，融合率=融合細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。圖2-2為研究路線圖。圖 2-2 長(zhǎng)心卡帕原生質(zhì)體獲得及融合路線圖Figure 2-2 Implementation plan of Kappaphycus alvarezii protoplast harvest and fusion2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2.3.1 原生質(zhì)體觀察與鑒定經(jīng)過市售商業(yè)酶或籃子魚肝胰臟研磨液酶解，都獲得了原生質(zhì)體，如下圖所示（圖 2-3）。

圖 2-3 長(zhǎng)心卡帕藻原生質(zhì)體Figure 2-3 Kappaphycus alvarezii proto藻組織細(xì)胞，可以看到較小深色皮又分為髓部大細(xì)胞和髓部小細(xì)胞（細(xì)胞，認(rèn)為此原生質(zhì)體來自于髓部
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2865635