在中國淡水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中,高產(chǎn)低值現(xiàn)象十分嚴重,急需提高我國淡水珍珠顆粒大小和品質(zhì),進而提升珍珠養(yǎng)殖效益,這也符合水產(chǎn)養(yǎng)殖轉型升級與綠色高質(zhì)量發(fā)展的要求。外套膜作為首選的育珠部位,空間小、組織薄,限制了大核珍珠的培育。而內(nèi)臟團不僅具有培育大型有核珍珠的空間條件,也具備育珠的生化條件。本論文圍繞內(nèi)臟團是否具有培育優(yōu)質(zhì)大型有核珍珠的分子條件這一問題,通過多組學分析手段,從mRNA與蛋白水平挖掘了外套膜與內(nèi)臟團珍珠培育進程中Ca~(2+)代謝及基質(zhì)蛋白的分子資源。本文比較三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團育珠進程中生物礦化相關基因和蛋白的差異表達,并對三角帆蚌珍珠形成過程中重要的基因VDCC(電壓依賴性鈣通道蛋白)和CABP(鈣結合蛋白)進行驗證和功能分析。該研究為提升內(nèi)臟團培育優(yōu)質(zhì)大型有核珍珠技術奠定了理論基礎。研究如下:1.基于Illumina技術測序平臺,利用雙末端測序(Paired-End)的方法構建了外套膜的轉錄組文庫,數(shù)據(jù)經(jīng)過濾和拼接后,得到257457條Unigenes,與Nr、Nt、Pfam、Swissprot、KO、GO和KOG等數(shù)據(jù)庫進行比對,共注釋223345條Unigenes,注釋率達到86.7%。從注釋的Unigenes中篩選并構建了珍珠形成和生長相關鈣代謝和基質(zhì)蛋白兩大模塊的基因庫。Ca~(2+)代謝基因1235條,其中直接與生物礦化相關基因415條;基質(zhì)蛋白426條,其中與貝殼和珍珠形成直接相關的基質(zhì)蛋白97條。2.通過高通量RNA-seq技術、數(shù)字表達譜(Digital gene expression,DGE),分析了三角帆蚌外套膜與內(nèi)臟團育珠進程的基因表達差異。數(shù)據(jù)分析結果顯示,外套膜和內(nèi)臟團之間的基因表達存在顯著性差異,以插核后20天(20thd)的差異表達基因數(shù)最多,其次是插核后120天(120 thd),未插核時基因表達也有較大差異,以插核后50天(50 thd)的差異表達基因數(shù)最少;Ca~(2+)代謝的差異表達基因數(shù)也表現(xiàn)出相同的趨勢;基質(zhì)蛋白的差異表達基因以120 thd最多,50thd最少。外套膜和內(nèi)臟團分別與對照組比較結果顯示,隨著育珠時間的延長,外套膜的差異表達基因數(shù)逐漸上升,而內(nèi)臟團則是先升后降;Ca~(2+)代謝和基質(zhì)蛋白的差異表達基因數(shù)量和種類不同。3.采用iTRAQ技術測定了三角帆蚌外套膜外膜、外套膜內(nèi)膜、珍珠囊和內(nèi)臟團蛋白質(zhì)圖譜,共鑒定肽段11522個、蛋白1871個。數(shù)據(jù)分析結果顯示,樣品間的總差異蛋白數(shù)和Ca~(2+)代謝相關差異蛋白表現(xiàn)出相同的規(guī)律,內(nèi)臟團與其它三個樣品間(外套膜外膜、外套膜內(nèi)膜和珍珠囊)的差異蛋白數(shù)都比較多,內(nèi)臟團與珍珠囊之間的差異蛋白最少,外套膜外膜和內(nèi)膜之間的差異蛋白也較多。KEGG數(shù)據(jù)庫共注釋241個pathways,以代謝通路(Metabolic pathways)的基因最多,與珍珠形成密切相關的鈣信號通路(Calcium signaling pathway)中,鈣調(diào)蛋白(CAML)、VDAC(線粒體外膜通道蛋白)、CaN(鈣調(diào)磷酸酶)、CAMK(鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶)等蛋白上調(diào)表達。從注釋數(shù)據(jù)中篩選與鈣代謝相關的蛋白包括鈣結合蛋白(CABP)、鈣調(diào)蛋白(CAM)、鈣黏蛋白(Cadherin)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道蛋白(RYR)、電壓依賴性鈣通道蛋白(VDCC)等,篩選與鈣代謝相關的基質(zhì)蛋白包括母系蛋白家族蛋白1(matrilin-1)、N66、和凝集素樣蛋白1(ASL1)。4.對篩選的鈣代謝相關基因VDCC和CABP進行驗證和功能分析。VDCC的cDNA全長1453bp,ORF從439-1053bp,編碼204個AA,系統(tǒng)進化樹分析顯示三角帆蚌的VDCC基因序列與其他水生生物同源性較低。差異表達分析顯示珍珠的培育對VDCC基因表達有影響,呈增長的趨勢,但差異不顯著。CABP的cDNA序列564bp,BLAST分析顯示該基因片段與帝國蛤蜊(Pseudocardium sybillae)及菲律賓綴錦蛤(Tapes philippinarum)的CABP基因相似性最高。差異表達分析顯示,CABP基因以外套膜組織表達量最高,鰓組織表達量最低。育珠狀態(tài)下除鰓組織外,其他組織的表達量均有增加趨勢,外套膜內(nèi)、外組織間的增長水平達到了顯著水平(P0.05)。不同濃度的Ca~(2+)孵育,CABP基因表達量隨著Ca~(2+)孵育濃度的增加而增加。相關分析結果顯示,CABP基因的mRNA表達水平與胞外Ca~(2+)流量有顯著的負相關(R=-0.993;P0.05),與胞內(nèi)Ca~(2+)熒光強度間有顯著強的正相關(P0.05)。綜合以上內(nèi)容,本研究認為內(nèi)臟團具有育珠的分子條件;但與外套膜相比,基礎代謝不同,育珠過程中的分子調(diào)控模式不同。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

clean reads 拼接起來→將 Trinity 與 GICL、cdhit 結源基因聚類分析得到的整合基因集→最后獲得了比例最低的 Unigene序列。學分析列與數(shù)據(jù)庫比對注釋，在 Unigene 序列差異表達法包括 GO分類分析以及 KEGG富集性分析。e 序列與 Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、進行基因功能注釋。對注釋成功的 Unigene 預件預測未注釋上的 Unigene 的 ORF，得其編碼區(qū)的量檢測結果

圖 2-4 GO 的分類圖Fig. 2-4 The diagram of gene function classification (GO)KOG 分類結果，轉錄組所組裝的 22718 條 Unigenes 分別分布于 26 個分子家族中，一般功能預測所占比例最高，19.6%，其次是信號轉導（19.2%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、分子伴侶（11.1%）、細胞骨架（6.5%）、轉錄（5.4%）、翻譯（5.3%）等所占比例也較高。2.3.4 鈣代謝基因庫構建從注釋的轉錄組數(shù)據(jù)中篩選了鈣調(diào)節(jié)基因 1313 條，其中與生物礦化相關的鈣代謝基因 415 條（附錄 3.1），主要包括鈣結合蛋白（calcium binding protein,CABP, CAB）、45 kDa 鈣結合蛋白（45 kDa calcium-binding protein）、含 EF-hand 鈣結合結構域蛋白（ EF-hand calcium-binding domain-containing protein,EFCAB）、N 末端含 EF-hand 鈣結合結構域蛋白（N-terminal EF-hand calcium-binding protein, NECAB ） 、 鈣 結 合 蛋 白 32 （ calbindin-32 ） 、 鈣 調(diào) 蛋 白

蛋白酶水解蛋白質(zhì)樣品→裂解的肽段用 iTRAQ 試劑進行差異標記→一級質(zhì)譜（質(zhì)譜與液體色譜聯(lián)用）→一級質(zhì)譜的前體離子經(jīng)過碰撞誘導解離（串聯(lián)質(zhì)譜的方法），通過二級質(zhì)譜對產(chǎn)物離子進行分析→蛋白質(zhì)定量信息處理。如圖 4-1 所示。
【參考文獻】

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本文編號：2864736