擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國東南沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖蟹類,具備高營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,但在養(yǎng)殖過程中容易遭受各種病害侵襲。近幾年來,為了更好地進(jìn)行病害防治,人們對(duì)青蟹自身免疫機(jī)制的研究逐漸增多。組織蛋白酶是一類溶酶體蛋白酶,廣泛參與機(jī)體的各種生理過程,包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解、酶原和激素原的激活、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑等,因此探索擬穴青蟹組織蛋白酶的功能特性對(duì)于深入了解甲殼動(dòng)物先天性免疫防御機(jī)制具有重要意義。目前對(duì)于組織蛋白酶的研究多集中于哺乳動(dòng)物,而對(duì)于無脊椎動(dòng)物尤其是甲殼動(dòng)物組織蛋白酶的研究還非常少。本課題組在前期研究工作中利用擬穴青蟹胚胎轉(zhuǎn)錄組篩選獲得組織蛋白酶B、L、D的同源基因片段,分別命名為SpCathB、SpCathL和SpCathD。本論文主要研究成果如下:1.克隆獲得了 SpCathB、SpCathL、SpCathD 的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。三種組織蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)都是由信號(hào)肽、前體肽和成熟肽組成,其中SpCathB和SpCathL屬于半胱氨酸蛋白酶而SpCathD屬于天冬氨酸蛋白酶。SpCathBORF序列全長999bp,編碼322個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)有三個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn);SpCathLORF序列全長1029bp,編碼342個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)有三個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn);SpCathD ORF序列全長1158 bp,編碼385個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)有兩個(gè)天冬氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)和一個(gè)非消化性組織蛋白酶D特征序列。2.揭示了 SpCathB、SpCathL、SpCathD在正常機(jī)體的組織分布特性以及在機(jī)體受到副溶血弧菌和LPS感染后的基因表達(dá)變化模式。結(jié)果表明SpCathB、SpCathL、SpCathD的表達(dá)特性十分相似,在正常雌、雄蟹所采集的各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá),其中肝胰腺和中腸的相對(duì)表達(dá)量較高。在機(jī)體遭受副溶血弧菌感染或LPS刺激后,SpCathB、SpCathL、SpCathD在肝胰腺、中腸和血淋巴細(xì)胞三個(gè)組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì),說明擬穴青蟹組織蛋白酶可能參與機(jī)體免疫反應(yīng)。3.獲得了純化的真核表達(dá)proSpCathL蛋白并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)proSpCathL進(jìn)行真核表達(dá),利用鎳離子金屬螯合親和層析獲得其純化蛋白,研究結(jié)果表明proSpCathL表達(dá)產(chǎn)物在酸性條件下能夠自催化形成約30 kDa的成熟肽。酶活性測(cè)定結(jié)果證明表達(dá)產(chǎn)物具有組織蛋白酶L活性,且測(cè)得最適pH為pH 5,最適溫度為30℃。4.初步探索了 SpCathB、SpCathL、SpCathD在細(xì)胞凋亡中的作用。共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SpCathB、SpCathL、SpCathD在轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞后均能進(jìn)入溶酶體。TUNEL檢測(cè)結(jié)果表明,單獨(dú)轉(zhuǎn)染SpCathB、SpCathL、SpCathD不能直接誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞凋亡,但將Sp-caspase與SpCathB、SpCathL、SpCathD分別共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象增多,說明這三個(gè)蛋白可能具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)證明,SpCathL只能降解Sp-caspase蛋白,但不能對(duì)其進(jìn)行催化激活,推測(cè)擬穴青蟹組織蛋白酶可能通過其他途徑對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。綜上,本研究一方面對(duì)SpCathB、SpCathL、SpCathD進(jìn)行了基礎(chǔ)的鑒定工作和基本特性研究,包括基因克隆、生物信息學(xué)分析、組織分布、細(xì)胞內(nèi)定位、真核表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究,另一方面對(duì)這三個(gè)基因在免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡方面的功能進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因都能夠參與機(jī)體的免疫響應(yīng),并且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,證明SpCathB、SpCathL、SpCathD是擬穴青蟹體內(nèi)重要的免疫因子,這為深入研究組織蛋白酶和無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

由于組織蛋白酶原可以進(jìn)行Ｎ－連接糖基化形成甘露糖殘基，隨后在高爾基??體內(nèi)發(fā)生磷酸化形成６－憐酸甘露糖（Ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，?Ｍ６Ｐ），因此可以通??過Ｍ６Ｐ受體通路轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)體和溶酶體中［７］（圖１－１）。??工、‘?＝＾?Ｉ??｜?Ｗｇｈ－ｍａｎｒｏ＆ｅ?ｇ＾ｙｃａｎ??Ｓ?Ｓ?（?１??ＥＨＪ??＿＿．?．ｐｌ＾ａ??Ｘｓ，ｅｅ—????＿■?＿?Ａｃｔｉｖｅ?ｓｉｔｅ?＿?＇??Ｅａｒ４ｙ?ｅｆｉｄｏｓｏｍｅ?Ｌｙｓｏｓｏｍｅ??圖１－１組織蛋白酶Ｌ的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑【７】??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ?ｏｆ?ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｌ??２??

除了適應(yīng)性免疫以外，組織蛋白酶還參與機(jī)體的先天性免疫，不僅配合溶酶??體參與細(xì)胞吞噬和細(xì)胞自噬，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、Ｔｏｌｌ樣受體（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ，??ＴＬＲ）信號(hào)通路以及炎癥反應(yīng)等過程（圖１－２），其中細(xì)胞凋亡功能會(huì)在本章第??３節(jié)中詳細(xì)介紹。Ｔｏｌｌ樣受體是一類模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別微生物中具有保守??結(jié)構(gòu)的分子并啟動(dòng)免疫響應(yīng)。研宄表明，組織蛋白酶Ｂ、Ｋ、Ｌ、Ｓ和Ｆ能夠切??割ＴＬＲ９［２３，２４１。盡管ＴＬＲ９全長蛋白和切割后的ＴＬＲ９蛋白都能與病原微生物的??４??

第１章緒論??細(xì)胞色素Ｃ向胞質(zhì)的釋放，而這一步驟主要受Ｂｃｌ－２家族蛋白調(diào)控細(xì)胞色素??Ｃ在細(xì)胞質(zhì)中能激活銜接蛋白Ａｐａｆ－１，而活化的Ａｐａｆ－１又能聚集并激活??ｃａｓｐａｓｅ－９，從而形成由細(xì)胞色素Ｃ、Ａｐａｆ－１和ｃａｓｐａｓｅ－９組成的調(diào)亡酶體，最終??激活效應(yīng)ｃａｓｐａｓｅｓ從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［３９］。外源性途徑又稱作死亡受體途徑，由??ＴＮＦ超家族成員中的跨膜受體蛋白（如Ｆａｓ、ＴＮＦＲ１等）與相關(guān)配體（如ＦａｓＬ、??ＴＮＦ－ｏｔ等）特異性結(jié)合，誘導(dǎo)寡聚化和構(gòu)象變化從而聚集銜接蛋白，引發(fā)下游??ｃａｓｐａｓｅｓ蛋白的活化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［４０】。通常認(rèn)為，內(nèi)源性細(xì)胞凋亡由某些??刺激物如病原微生物、福射、活性氧分子（Ｒｅａｃｔｉｖｅ?ｏｘｙｇｅｎ?ｓｐｅｃｉｅｓ，?ＲＯＳ）、錯(cuò)??誤折疊蛋白的累積等引發(fā)，而外源性細(xì)胞凋亡則是在個(gè)體發(fā)育、變異和細(xì)胞重構(gòu)??時(shí)發(fā)生Ｈｉ］。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2863866