氣單胞菌(Aeromonas)在水生生態(tài)系統(tǒng)中無處不在,存在于新鮮的河口水、地表水、污水、健康或患病魚、食品、動(dòng)物和人類糞便中,能夠引起人和魚類的感染。氣單胞菌屬是眾所周知的魚類條件致病菌,在應(yīng)激條件下,如水溫增加、水質(zhì)不佳等,是疫情爆發(fā)的主要原因。為了確定南京市某漁場(chǎng)發(fā)病魚感染的病原,本試驗(yàn)采集患魚臟器,采用平板培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)和種特異性gyrB基因擴(kuò)增測(cè)序等方法進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定;利用PCR技術(shù)檢測(cè)分離株毒力基因的分布,分析其生物學(xué)特性,并進(jìn)一步通過動(dòng)物試驗(yàn)確定菌株致病力。結(jié)果分離到1株水族箱氣單胞菌,命名為L(zhǎng)K13-25。該菌株攜帶5種主要毒力基因:氣溶素(aer)、細(xì)胞毒性腸毒素(aact)、細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、溫敏胞外蛋白酶(epr)和絲氨酸蛋白酶(ahP),溶血性和溶蛋白能力較強(qiáng),對(duì)斑馬魚的半數(shù)致死量為1.02×103CFU/尾,確定為強(qiáng)毒株。進(jìn)化樹分析表明,水族箱氣單胞菌與嗜水氣單胞菌達(dá)卡亞種親緣關(guān)系較近。本研究在國內(nèi)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)水族箱氣單胞菌,為進(jìn)一步預(yù)防該菌所引起的相關(guān)疾病的發(fā)生和傳播提供理論基礎(chǔ)。為調(diào)查南京地區(qū)漁場(chǎng)的氣單胞菌感染情況,于2013年10月至2014年10月,從發(fā)病、健康水生動(dòng)物及水體環(huán)境中采集163份樣品,采用平板培養(yǎng)和特異性gyrB基因擴(kuò)增測(cè)序等方法進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定;利用PCR技術(shù)檢測(cè)分離株6種主要毒力基因act、alt、epr、ahp、ascV的分布;通過動(dòng)物試驗(yàn)確定部分菌株致病力。結(jié)果顯示,共鑒定出氣單胞菌菌株147株,主要菌種為維氏氣單胞菌(A.veronii)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila),檢出率分別為46.3%和34.7%;毒力基因中,除ascV之外,檢出率都在50%以上,最高為94.6%,最低為68.0%;以斑馬魚為模型,對(duì)不同種的氣單胞菌進(jìn)行LD50的測(cè)定,結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌的LD50明顯高于其他種。以上結(jié)果可以看出,氣單胞菌在南京地區(qū)漁場(chǎng)環(huán)境中廣泛分布,并且含有多種毒力基因,具有潛在的公共危害,尤其以嗜水氣單胞菌需要更多的關(guān)注。為了解嗜水氣單胞菌分離株的O抗原情況,對(duì)所有已知嗜水氣單胞菌O抗原基因簇進(jìn)行分析,篩選出共同存在的單糖合成基因rmlA、rmlC和rmlD,對(duì)嗜水氣單胞菌新分離株及實(shí)驗(yàn)室原保存菌株共71株進(jìn)行分型,最后用MLST方法對(duì)部分菌株進(jìn)行分類比較。結(jié)果顯示,71株嗜水氣單胞菌中共能檢出57株與已知相一致的O抗原基因簇型,其中與中國流行菌株NJ-35和美國流行菌株ML09-119 O抗原基因簇相一致的菌株所占比重比較大,分別為56.14%(32/57)和33.33%(19/57)。比對(duì)MLST分析結(jié)果,除CS-43、JH-17株之外,NJ-35和ML09-119O抗原基因簇型的菌株都屬于ST251和ST328,而兩個(gè)型的菌株在斑馬魚致病性試驗(yàn)中都為強(qiáng)毒株,說明嗜水氣單胞菌O抗原單糖合成相關(guān)基因與菌株的致病力有一定的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示,江蘇地區(qū)的嗜水氣單胞菌的流行株的O抗原基因簇型為NJ-35型和ML09-119型,O抗原基因簇相關(guān)基因分型方法可以作為一種新的分子分型方法應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的流行病學(xué)調(diào)查中。綜上所述,本研究對(duì)南京地區(qū)的氣單胞菌感染情況進(jìn)行了調(diào)查,并在國內(nèi)首次分離到水族箱氣單胞菌,同時(shí)對(duì)71株嗜水氣單胞菌進(jìn)行O抗原基因分型,研究結(jié)果為開展氣單胞菌感染的流行病學(xué)調(diào)查和防控奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S941.4
【部分圖文】：

?２．２細(xì)菌的分子鑒定??分離菌株的ＰＣＲ擴(kuò)増結(jié)果中，條帶大小跟預(yù)期目的大小一致（圖２－１）。巧ｒ公基??因序列比對(duì)結(jié)果表明，與目的基因序列同源性最高的菌株為水族箱氣單胞苗ＭＤＣ?４７，??為?９９〇／〇。??ｌＯＯＯｂｐ＾＾＾Ｈ＾Ｈ?ｌｌＯＯｂｐ??７５。桶??圖２－１?ｇ）７■公基因的ＰＣＲ檢測(cè)??Ｍ：?２０００ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：菌株ＬＫ１３－２５；?２：菌株ＮＪ－３５；?３：陰性對(duì)照。??Ｆｉｇ．２－１?ＰＣ民?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆｇｙｒ公??Ｍ；?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?ｌ：ＬＫ－２５；?２；?ＮＪ－３５；?３：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??進(jìn)化樹分析表明，水族箱氣單胞菌ＬＫ１３－２５與嗜水氣單胞菌達(dá)卡亞種??（乂／ｙ堿＊０／７／２／／ａｓｓｐ？抓施親緣關(guān)系較近，最大相似度９６％?（圖２－２）。??３１??

Ｆｉｇ．２－２?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓ?ｓｐｅｃｉｅｓ??２．３毒力基因的檢測(cè)??７種毒力基因的存在情況如圖２－３所示。除ｆｌｓｃ戶和ｉｊｅｒ外，水族箱氣單胞菌ＬＫｌ?３－２５??存在其他５種毒力基因，說明該苗具有潛在的致病性。??３２??

?１??０．０１??圖２－２氣單胞菌屬細(xì)菌的遺傳演化分祈??Ｆｉｇ．２－２?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓ?ｓｐｅｃｉｅｓ??２．３毒力基因的檢測(cè)??７種毒力基因的存在情況如圖２－３所示。除ｆｌｓｃ戶和ｉｊｅｒ外，水族箱氣單胞菌ＬＫｌ?３－２５??存在其他５種毒力基因，說明該苗具有潛在的致病性。??３２??
【參考文獻(xiàn)】

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