紅鯽因其擁有鮮艷的紅色體色而備受人們喜愛,是具有重要觀賞價值的觀賞魚品種之一。然而,紅鯽在體色發(fā)育過程中存在“青轉紅”的現象,即黑色素細胞先增加后減少,體色由青灰色轉變?yōu)榧t色的現象。探究這種“青轉紅”現象的遺傳分子調控機制,有利于人們更好地理解黑色素細胞發(fā)育的分子遺傳機理。因此,本研究利用轉錄組高通量測序技術檢測了紅鯽不同體色發(fā)育時期皮膚組織中基因表達信息,通過高通量測序技術結合MethylRAD甲基化測序技術研究了成體紅鯽與白鯽皮膚組織中基因表達信息和DNA甲基化位點信息,同時利用了 CRISPR/Cas9基因敲除技術和過表達質粒載體構建技術探究了體色發(fā)育相關基因的具體功能。具體研究結果如下:1.通過組織學觀察技術,我們跟蹤研究了紅鯽體色發(fā)育的各個時期中色素細胞的組成和變化情況,發(fā)現黑色素細胞最早出現在受精后48h(hpf),孵化出膜后1天(ldph)時黃色素細胞在頭部出現,7dph左右虹彩細胞在腹部少量出現;胚胎及幼苗紅鯽體表黑色素細胞逐漸增多,45～60d左右紅鯽體表黑色素細胞開始凝集減少,大約在90d左右黑色素細胞完全消褪,此時黃色素細胞與紅色素細胞逐漸增多,最后紅鯽通體呈現出紅色體色。2.通過RNA-Seq技術首次獲得了紅鯽變色前(GC)、變色中(CV)和變色后(RC)這三個不同體色發(fā)育階段的轉錄組信息,分別得到了103,229、108,208和120,184個轉錄本。通過SNP序列分析,分別得到了 187,616、191,213和218,780個SNP位點。通過生物信息學分析顯示,在CV和GC、RC和CV、RC和GC之間分別存在2483、2967和4473個差異表達基因。這些差異表達基因的一部分參與了色素合成的信號通路,如黑色素生成通路中的基因(Mitfa、Pax3a、Foxd3、Mclr、Asip),酪氨酸代謝基因(Tyr、Dct、Tyrp1、Silva、Tat、Hpda)和Pteridine代謝基因(Gch1、Xdh、Ptps、Tc)等。轉錄組學分析和qPCR檢測結果均表明,Mitfa與Tyr、Tyrp1、Dct、Tfe3a和Baxa等重要色素發(fā)育基因與紅鯽“青轉紅”體色變遷密切相關;Mitfa扣可能作為主控基因通過調控黑色素合成或黑素細胞發(fā)育有關的基因表達在紅鯽體色形成中起著重要作用。3.通過高通量技術研究了成體紅鯽與白鯽皮膚組織基因表達信息,組裝后分別得到了 56,564和56,612條Unigenes,紅鯽與白鯽存在7117個差異表達基因,其中3434個基因在紅鯽中高表達,3683個基因在白鯽中高表達,通過qPCR驗證發(fā)現,黑色素合成相關基因如Tyr、Dct、Tyrp1和Mc1r在紅鯽皮膚中低表達,而其他色素合成相關基因如Foxd3、Hpda、Ptps、Gchl和Sox9b則在紅鯽皮膚中高表達。通過KEGG富集分析發(fā)現,在黑色素合成信號通路、糖異生和酪氨酸代謝等信號通路中存在大量差異表達基因的富集。4.通過MethylRAD甲基化測序技術研究了成體紅鯽與白鯽皮膚中DNA甲基化位點信息,在紅鯽與白鯽皮膚中分別得到了 17,147,966和16,568,891個甲基化標簽,比對率分別為21.45%和18.08%。在紅鯽與白鯽中分別得到了 96,122和88,536個CCGG甲基化位點,其平均深度分別為30.71和28.35;分別得到了 7,961和9,534個CCWGG甲基化位點,其平均深度分別為9.18和9.02。發(fā)現在色素發(fā)育相關基因如Tyr、Dct、Foxd3、Mitfa和Hpda等基因中均存在差異甲基化位點。通過KEGG富集分析發(fā)現在MAPK信號通路、cAMP信號通路、黑色素合成和Hippo等信號通路中存在大量差異甲基化基因,這些結果表明DNA甲基化在鯽魚體色形成過程中起著重要作用。5.通過CRISPR/Cas9基因敲除與過表達載體技術,在紅斑馬魚敲除了黑色素細胞調控基因Mitfa,發(fā)現Mitfa基因突變會導致紅斑馬魚早期皮膚黑色素細胞缺失,過表達Mitfa發(fā)現其在早期能夠增加黑色素細胞的表達,但不能拯救黑色素細胞最終的消退。綜上所述,本研究利用高通量RNA-Seq技術在紅鯽不同體色發(fā)育時期,獲得了大量的差異表達基因和SNP位點信息,分析結果表明了在紅鯽體色發(fā)育中Mitfa為主控基因調控Tyr和Dct等基因的表達,通過黑色素合成代謝途徑調控著紅鯽“青轉紅”的體色轉變。Mitfa基因敲除與過表達分析進一步證實了Mitfa基因對魚類黑色素細胞發(fā)育的重要調控功能。利用RNA-Seq和MethylRAD技術比較分析了成體紅鯽與白鯽皮膚組織中差異表達基因與DNA甲基化位點信息,證實了黑色素合成關鍵酶Tyr基因的甲基化水平與體色密切關聯。本研究中所獲得的大量轉錄組學數據和DNA甲基化位點信息,為進一步揭示魚類體色發(fā)育調控機制提供了分子遺傳學依據。
【學位單位】：湖南師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

?素細胞。在４８ｈｐｆ時，眼色素出現，之后黑色素細胞在頭部，背部和腹部相繼增??加（圖２－１，Ａ）；在５６ｈｐｆ時黑色素逐漸分布在紅鯽全身（圖２－１，Ｂ）；在７０ｈｐｆ時??在頭部和背部可以觀察到一些黃色素細胞，７２ｈｐｆ左右卵膜破裂，此時紅鯽出膜??（圖２－１，Ｃ）。在紅鯽出膜后３ｄ左右可以觀察有魚鰾出現，在７ｄｐｈ左右在腹部出??現一些虹彩細胞（圖２－１，Ｄ），同時在尾部也觀察到有黃色素細胞、紅色素細胞和??黑色素細胞（圖２－１，Ｆ）。在適宜的溫度和ＰＨ環(huán)境下，紅舞有一部分幼魚在６０ｄｐｈ??左右，黑色素細胞開始從背部脫落，呈現出淡黃色的表型（圖２－１，Ｇ，Ｈ）。最后??在９０ｄ左右大部分紅鯽黑色素細胞褪去呈現出橙色體色，最后逐漸變成紅色體色??（圖?２－１，Ｉ）。??ＡＢＣ??ｉｔｓ．??＿?—??ｊｆｆ??－??Ｇ?Ｈ?Ｉ??ｒ?ｔ??圖２－１紅鯽不同體色發(fā)育時期體色觀察．Ａ：４８ｈｐｆ（４ｘ）；?Ｂ：４８ｈｐｆ（ｌ〇ｘ）；?Ｃ：?０ｄｐｈ（２０ｘ）；??Ｄ：７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｅ：７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｆ：?７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｇ：變色前（４０ｄ）；?Ｈ：變色中（６０ｄ）；?Ｉ：變色后（９０ｄ）。??其中Ｍ代表黑色素細胞

?織中色素細胞的形態(tài)和結構。其中在青灰色（ＧＣ）時期（ａ）、體色改變（ＣＶ）時期（ｂ）??和變色后紅色（ＲＣ）時期（ｃ）的幼魚（圖２－２，?ａ，ｂ，ｃ）。在紅鯽４０ｄｐｈ時，背部皮膚??組織中黑色素細胞和黃色素細胞同時存在，且黑色素細胞既有黑色素活躍的分枝??狀又有黑色素細胞凝集態(tài)的圓形態(tài)；此時黃色素細胞也存在著分枝態(tài)和圓形態(tài)，??但大多分布在頭背部（圖２－２，?ｄ）；通過透射電鏡觀察黑色素細胞大多呈現圓形小??點而黃色素細胞也能看到但呈現彌散狀（圖２－２，?ｅ）。在紅鯽６０ｄｐｈ時，黑色素細??胞數量出現了減少的趨勢，且黃色素細胞有增加的趨勢，黑色素細胞分枝態(tài)減少，??凝集態(tài)增加最后縮小直至消失（圖２－２，?ｈ）。其中觀察到含有黑色素細胞（黑箭頭）、??黃色素細胞和紅色素細胞，但在ＲＣ皮膚中沒有黑素細胞。通過透射電鏡觀察黑??色素細胞明顯減少

圖３－１紅鯽皮膚轉錄組拼接Ｕｎｉｇｅｎｅｓ長度分布概率統(tǒng)計圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｔｈｅ?ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ?ｇｒａｐｈ?ｏｆ?ｕｎｉｇｅｎｅｓ?ｌｅｎｇｔｈ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｋｉｎ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ?ｏｆ??ｒｅｄ?ｃｒｕｃｉａｎ?ｃａｒｐ??３．３．２紅鯽轉錄組組裝數據的功能注釋結果??
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本文編號：2856313