無乳鏈球菌是革蘭氏陽性細(xì)菌,屬于B族鏈球菌(Group B Streptococcus,GBS),是引起我國南方地區(qū)羅非魚鏈球菌病的主要病原菌之一。近年來,羅非魚鏈球菌病頻繁發(fā)生,使我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因此,對無乳鏈球菌的防治和研究迫在眉睫。研究表明,無乳鏈球菌的毒力受到溫度的調(diào)控,在水溫超過35℃時(shí)能引起羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)和流行。為了研究篩選魚源無乳鏈球菌毒力相關(guān)基因,以不同溫度(25℃和37℃)下培養(yǎng)的無乳鏈球菌ZQ0910為研究對象,將該菌在25℃和37℃下分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期,然后對這兩個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選無乳鏈球菌毒力相關(guān)基因和預(yù)測sRNA;并通過熒光定量PCR技術(shù)對篩選得到的毒力相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證;利用RT-PCR方法對預(yù)測的部分sRNA進(jìn)行驗(yàn)證。其結(jié)果為研究魚源無乳鏈球菌的毒力基因功能及sRNA的調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。具體研究內(nèi)容如下:1.將25℃和37℃下分別培養(yǎng)的無乳鏈球菌樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,結(jié)果表明37℃樣本(Test)基因表達(dá)總數(shù)為1929條,25℃樣本(CK)基因表達(dá)總數(shù)是1935條。樣品間表達(dá)顯著差異基因總數(shù)為673條,顯著上調(diào)差異基因146條,顯著下調(diào)差異基因527條。Pathway富集分析表明,1215條基因注釋到KEGG的105條通路上,包含447個(gè)顯著性差異基因;其中顯著富集通路有40條,差異最顯著的通路包括代謝相關(guān)的通路、生物合成相關(guān)通路、修復(fù)相關(guān)通路和信號通路等。2.從無乳鏈球菌轉(zhuǎn)錄組中篩選到7個(gè)毒力相關(guān)基因,即cylI、cylA、cylK、cyl J、cylG、sodA和PI-2b。首先,對7個(gè)毒力相關(guān)基因克隆并進(jìn)行生物信息分析,然后,利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示:7個(gè)毒力相關(guān)基因都能夠克隆到全長;7個(gè)基因的熒光定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的表達(dá)趨勢一致,只是相對表達(dá)量的倍數(shù)有所差異�？偟膩碚f,轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的可靠性較高。3.從無乳鏈球菌轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測到sRNA 167條,對部分預(yù)測的sRNA應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示:SAR-1、SAR-9、SAR-4、SAR-14、SAR-T克隆獲得的片段長度分別是178bp、139bp、110bp、165bp、111bp,而且,克隆獲得的基因片段都能夠完全比對到各自預(yù)測的sRNA序列上。說明這幾個(gè)sRNA存在于無乳鏈球菌ZQ0910。
【學(xué)位單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S943
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 無乳鏈球菌國內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.1.1 無乳鏈球菌的特點(diǎn)
        1.1.2 無乳鏈球菌致病性的研究進(jìn)展
    1.2 鏈球菌屬sRNAs的研究
        1.2.1 鏈球菌屬中預(yù)測和鑒定sRNAs的方法
        1.2.2 鏈球菌sRNAs的多樣性
        1.2.3 鏈球菌屬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的sRNAs
    1.3 本研究的目的及意義
2 無乳鏈球菌ZQ0910轉(zhuǎn)錄組測序分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 無乳鏈球菌ZQ0910生長曲線的制作
        2.2.2 菌株活化及培養(yǎng)
        2.2.3 取菌送測
        2.2.4 測序數(shù)據(jù)分析
        2.2.5 比對統(tǒng)計(jì)
        2.2.6 基因統(tǒng)計(jì)
        2.2.7 基因注釋及功能預(yù)測
        2.2.8 sRNA預(yù)測
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 無乳鏈球菌ZQ0910總RNA質(zhì)量檢測
        2.3.2 無乳鏈球菌ZQ0910轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
        2.3.3 樣品間差異分析結(jié)果
        2.3.4 樣品間差異基因注釋及功能預(yù)測
    2.4 討論
3 無乳鏈球菌ZQ0910毒力相關(guān)基因的克隆和驗(yàn)證
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要溶液和培養(yǎng)基
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 無乳鏈球菌ZQ0910的培養(yǎng)
        3.2.2 無乳鏈球菌ZQ0910總RNA的提取
        3.2.3 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
        3.2.4 毒力相關(guān)基因的克隆
        3.2.5 毒力相關(guān)基因的驗(yàn)證
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 cylA基因的克隆與分析
        3.3.2 cylG基因的克隆與分析
        3.3.3 cylI基因的克隆與分析
        3.3.4 cylJ基因的克隆與分析
        3.3.5 cylK基因的克隆與分析
        3.3.6 sodA基因的克隆與分析
        3.3.7 PI-2b基因的克隆與分析
        3.3.8 熒光定量驗(yàn)證結(jié)果
    3.4 討論
4 無乳鏈球菌ZQ0910 sRNA的驗(yàn)證
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 候選sRNA序列
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 主要儀器
        4.1.5 主要溶液和培養(yǎng)基
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 無乳鏈球菌ZQ0910總RNA的提取
        4.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
        4.2.3 sRNA的RT-PCR
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 無乳鏈球菌ZQ0910總RNA的提取
        4.3.2 無乳鏈球菌ZQ0910 cDNA模板合成
        4.3.3 sRNA SAR-1、SAR-9、SAR-4、SAR-14、SAR-T克隆結(jié)果與分析
    4.4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：2852248