隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的研究深入,在病原分子基因水平、感染傳播和對(duì)蝦免疫保護(hù)方面取得了豐碩的研究成果,但在防控技術(shù)上未能獲得理想的防治效果。本實(shí)驗(yàn)旨在調(diào)查了解養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦WSSV檢出率和發(fā)病情況,應(yīng)用前期篩選的抗WSSV專用中草藥HD-3進(jìn)行感染臨床試驗(yàn),通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析對(duì)蝦死亡率和對(duì)蝦免疫酶活數(shù)據(jù),結(jié)合熒光定量PCR、組織病理學(xué)檢測(cè)和超微病理學(xué)檢測(cè),確定投喂中草藥的最佳預(yù)防方案,并開(kāi)展中試試驗(yàn)檢驗(yàn)生產(chǎn)療效。1.在2014年7月-2015年12月,對(duì)遼寧、河北、天津、山東和浙江五省份,楊家泊、濱州、濰坊、膠南等環(huán)黃渤海凡納濱對(duì)蝦主產(chǎn)區(qū),共采集29批次樣品。每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)樣品定義為同一批次,進(jìn)行WSSV病原攜帶率和養(yǎng)殖工藝調(diào)查。通過(guò)DNA提取,利用套式PCR和熒光定量PCR診斷凡納濱對(duì)蝦的WSSV陽(yáng)性率。結(jié)果顯示,在北方凡納濱對(duì)蝦主要產(chǎn)區(qū)通過(guò)套式PCR方法,WSSV陽(yáng)性檢出率高達(dá)72.4%;通過(guò)熒光定量方法,WSSV檢出率達(dá)86.2%。熒光定量檢測(cè)方法敏感度在101copies/mg優(yōu)于套式PCR。傳統(tǒng)土塘養(yǎng)殖工藝凡納濱對(duì)蝦WSSV檢出率和感染程度高于大棚養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖模式。2.基礎(chǔ)飼料添加3%HD-3復(fù)方中草藥做藥餌,每天2次投喂量占對(duì)蝦體重5%,水體溫度25~28℃,鹽度18~20‰,溶解氧6.5mg/L以上。投喂1d、4d、7d、10d、13d、16d和19d藥餌后進(jìn)行口服WSSV毒餌感染方式攻毒,統(tǒng)計(jì)對(duì)蝦癥狀表現(xiàn)和死亡率,測(cè)定對(duì)蝦酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)四種免疫因子。結(jié)果顯示:在飼料中添加HD-3中草藥,可以起到保護(hù)對(duì)蝦的作用,預(yù)防13d、16d和19d在試驗(yàn)結(jié)束后仍有存活對(duì)蝦,其中實(shí)驗(yàn)組16d獲得最高的免疫保護(hù)率,達(dá)到36.7±3.3%,存活者健康與空白對(duì)照組對(duì)蝦無(wú)異。服用HD-3 10d以后,可以顯著提高對(duì)蝦PO、SO D和AKP活力(P0.05),緩慢提升ACP活力(P0.05)。攻毒后服用較長(zhǎng)時(shí)間中草藥的實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦,PO、SOD、AKP和ACP活力可以獲得更持久的免疫活性。3.通過(guò)熒光定量對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組不同感染時(shí)期凡納濱對(duì)蝦腮組織內(nèi)病毒進(jìn)行定量分析,顯示隨著服用中草藥時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)蝦體內(nèi)病毒增長(zhǎng)幅度和最大峰值總體上低于陽(yáng)性對(duì)照組。在感染72h后,陽(yáng)性對(duì)照組病毒含量達(dá)到106 copies/mg峰值時(shí),服用中草藥10d以后實(shí)驗(yàn)組病毒含量顯著小于陽(yáng)性對(duì)照組(P0.05),仍在104 copies/mg數(shù)量級(jí)。而存活對(duì)蝦體內(nèi)病毒含量整體較低,處于103 copies/mg數(shù)量級(jí)以下。通過(guò)組織病理觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核腫大程度(SOI),發(fā)現(xiàn)SOI與WSSV感染程度成正比,在腮組織和胃組織內(nèi),實(shí)驗(yàn)組10d-19d在感染后SOI整體上低于陽(yáng)性對(duì)照組,表現(xiàn)出良好的保護(hù)率。并且攻毒后存活對(duì)蝦SOI大多處于中度感染以下。在超微組織病理分析中,陽(yáng)性對(duì)照組中,腮、胃和甲殼下表皮中受WSSV感染細(xì)胞數(shù)目和完整WSSV病毒含量明顯多于用藥組的存活對(duì)蝦。在用藥組中對(duì)蝦病毒形態(tài)多表現(xiàn)為大多數(shù)細(xì)胞完整,有稀疏、少量的病毒粒子存在,囊膜和核衣殼組裝多數(shù)不完整,亞細(xì)胞器諸如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等較清晰完整。超微電鏡觀察結(jié)果與熒光定量和SOI結(jié)果相符,推測(cè)該中草藥HD-3對(duì)阻斷WSSV侵染和細(xì)胞內(nèi)增殖有顯著效果。4.將抗WSSV中草藥HD-3在WSSV陽(yáng)性檢出的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行中試試驗(yàn),試驗(yàn)周期28天。經(jīng)過(guò)整個(gè)養(yǎng)殖周期,對(duì)蝦沒(méi)有爆發(fā)白斑綜合征,由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析顯示,抗WSSV中草藥實(shí)驗(yàn)組顯著提高了對(duì)蝦的增重率和成活率(P0.05)。添加中草藥可以在一定程度上提高對(duì)蝦免疫活力,尤其在高溫期,PO和ACP顯著高于對(duì)照組。通過(guò)定量PCR,顯示中草藥對(duì)WSSV有減緩增殖的趨勢(shì)。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S945.4
【部分圖文】：

驗(yàn)方法查采樣方法 年 7 月~2015 年 12 月期間，對(duì)遼寧、河北、天津、山東、江濱對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)成期的對(duì)蝦進(jìn)行樣品采集，總共 29 個(gè)樣品（養(yǎng)殖池塘、簡(jiǎn)易養(yǎng)殖大棚、工廠化養(yǎng)殖車間等養(yǎng)殖模式。樣個(gè)樣品 10-30 頭，充氧運(yùn)輸至青島中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水以供對(duì)蝦外觀病癥分析、提取 DNA 之用。定義每次采樣中一本，混合 10 尾蝦的腮組織保存在液氮中備用。

2.2.1 對(duì)蝦 WSSV 陽(yáng)性檢測(cè)經(jīng)過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行套式 PCR 發(fā)現(xiàn)，在一擴(kuò)條帶中，由圖 2-2 和陽(yáng)性對(duì)照中有明顯的 1447bp 特異性條帶，而其他樣品和陰性對(duì)照中沒(méi)有出現(xiàn)條帶。說(shuō)明 B1、F1、G3 受 WSSV 感染，而且感染程度較高。以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增 PCR，由圖 2-3 顯示，A1、B1、B3、B4、C1、C2、E1、E2、F1、F2、F3、F5、F6、G1、G3、I1、J1、K1、K2、K4 和 M1 對(duì)蝦基因組可以擴(kuò)增出 941bp 的特異性片段。說(shuō)明這些樣品也是 WSSV 感染體，但是感染程度不大，處于較弱感染狀態(tài)。圖 2-4 顯示，各樣品和陽(yáng)性樣品都擴(kuò)增出 848bp 的片段，且陰性對(duì)照沒(méi)有條帶，陽(yáng)性對(duì)照條帶明顯，說(shuō)明各樣品都是有效的。B2、D1、F4、G2、G4、H1、K3、L1 在一擴(kuò)和二擴(kuò) PCR 產(chǎn)物中無(wú)特異性條帶，表現(xiàn)為陰性。

2.2.1 對(duì)蝦 WSSV 陽(yáng)性檢測(cè)經(jīng)過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行套式 PCR 發(fā)現(xiàn)，在一擴(kuò)條帶中，由圖 2-2 和陽(yáng)性對(duì)照中有明顯的 1447bp 特異性條帶，而其他樣品和陰性對(duì)照中沒(méi)有出現(xiàn)條帶。說(shuō)明 B1、F1、G3 受 WSSV 感染，而且感染程度較高。以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增 PCR，由圖 2-3 顯示，A1、B1、B3、B4、C1、C2、E1、E2、F1、F2、F3、F5、F6、G1、G3、I1、J1、K1、K2、K4 和 M1 對(duì)蝦基因組可以擴(kuò)增出 941bp 的特異性片段。說(shuō)明這些樣品也是 WSSV 感染體，但是感染程度不大，處于較弱感染狀態(tài)。圖 2-4 顯示，各樣品和陽(yáng)性樣品都擴(kuò)增出 848bp 的片段，且陰性對(duì)照沒(méi)有條帶，陽(yáng)性對(duì)照條帶明顯，說(shuō)明各樣品都是有效的。B2、D1、F4、G2、G4、H1、K3、L1 在一擴(kuò)和二擴(kuò) PCR 產(chǎn)物中無(wú)特異性條帶，表現(xiàn)為陰性。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉慶慧;韓文君;楊冰;黃倢;;WSSV-VP39基因克隆與結(jié)構(gòu)分析[J];海洋水產(chǎn)研究;2007年05期

2 劉慶慧,黃倢,宋曉玲,劉莉;WSSV蛋白酶性質(zhì)的研究[J];中國(guó)水產(chǎn)科學(xué);2004年01期

3 易志剛,黃倢,李筠;WSSV結(jié)構(gòu)、功能及基因組學(xué)研究概況[J];海洋水產(chǎn)研究;2004年01期

4 劉慶慧,黃倢,韓文君;WSSV3個(gè)編碼蛋白的基因密碼子偏愛(ài)性分析[J];海洋水產(chǎn)研究;2005年04期

5 張家松;董雙林;田相利;董云偉;;浮游微藻攜帶和傳播WSSV的研究[J];海洋環(huán)境科學(xué);2007年03期

6 張俊儒;劉萍;王清印;李健;戴芳鈺;;溫度對(duì)WSSV感染中國(guó)對(duì)蝦越冬親蝦的影響[J];中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年03期

7 劉慶慧;陳婷;黃倢;;重組畢赤酵母SMD1168/pGAPZaA-VAP1穩(wěn)定性及發(fā)酵表達(dá)WSSV-VAP1[J];海洋水產(chǎn)研究;2008年05期

8 張秀麗;楊嘯;劉慶慧;馬璀艷;黃倢;;發(fā)酵條件對(duì)細(xì)菌工程菌產(chǎn)WSSV-VP37的影響[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2009年02期

9 韋秀梅;繩秀珍;唐小千;邢婧;戰(zhàn)文斌;;兔抗對(duì)蝦白斑癥病毒(WSSV)獨(dú)特型抗體的制備及其特性分析[J];海洋與湖沼;2010年02期

10 ;Characterization and Diagnostic Use of a Monoclonal Antibody for VP28 Envelope Protein of White Spot Syndrome Virus[J];Virologica Sinica;2011年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 羅坤;近交對(duì)中國(guó)對(duì)蝦生長(zhǎng)、養(yǎng)殖存活率和抗WSSV性狀的影響及“黃海2號(hào)”主要性狀的遺傳參數(shù)估計(jì)[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

2 謝世筠;利用酵母雙雜交解析WSSV感染凡納濱對(duì)蝦途徑的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2016年

3 張家松;浮游生物傳播對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

4 姜有聲;用單克隆抗體研究對(duì)蝦白斑癥病毒（WSSV）的黏附蛋白[D];中國(guó)海洋大學(xué);2006年

5 孟憲紅;中國(guó)對(duì)蝦“黃海2號(hào)”對(duì)WSSV的抗病性分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

6 唐小千;中國(guó)對(duì)蝦白斑癥病毒（WSSV）血細(xì)胞受體蛋白的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

7 梁艷;白斑綜合征病毒（WSSV）粘附蛋白及與其相互作用的對(duì)蝦細(xì)胞膜蛋白定位[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2005年

8 鐘汝杰;中國(guó)對(duì)蝦整合素β亞基與對(duì)蝦白斑癥病毒（WSSV）感染的相互關(guān)系研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2013年

9 朱斐;對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）滅活制劑及多糖對(duì)克氏原螯蝦抗WSSV作用的研究[D];浙江大學(xué);2009年

10 賴曉芳;中國(guó)對(duì)蝦應(yīng)答WSSV侵染相關(guān)基因的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黃家駿;白斑綜合癥病毒（WSSV）進(jìn)入造血組織細(xì)胞的途徑，紅螯螯蝦網(wǎng)格蛋白輕鏈的克隆及制備抗體的檢測(cè)[D];國(guó)家海洋局第三海洋研究所;2015年

2 劉鵬飛;硫氧還原蛋白與腫瘤蛋白在WSSV感染中作用及凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后代謝物的變化[D];大連海洋大學(xué);2015年

3 關(guān)廣闊;三個(gè)Tetraspanin蛋白的表達(dá)及其在WSSV感染中的作用分析[D];上海海洋大學(xué);2015年

4 夏小明;對(duì)蝦WSSV和IHHNV病毒重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）快速檢測(cè)方法的研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

5 胡文娟;野生和養(yǎng)殖對(duì)蝦IHHNV和WSSV共感染調(diào)查及其對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

6 朱衛(wèi)衛(wèi);肽聚糖對(duì)siRNA抑制凡納濱對(duì)蝦WSSV的強(qiáng)化及其轉(zhuǎn)錄組研究[D];廣東海洋大學(xué);2015年

7 張玲;白斑綜合征病毒（WSSV）膠體金免疫半定量快速檢測(cè)試紙條的研制與應(yīng)用[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

8 王修芳;對(duì)蝦Coat-ε、CCAP17和CHC的克隆、表達(dá)及其在WSSV感染中的作用[D];大連海洋大學(xué);2016年

9 景亞運(yùn);HD-3復(fù)方中草藥對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫酶影響和抗WSSV感染分析[D];大連海洋大學(xué);2016年

10 楊賀;WSSV的感染、高效檢測(cè)及生物信息學(xué)分析[D];蘇州大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2850158