隨著國內(nèi)外學(xué)者對對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的研究深入,在病原分子基因水平、感染傳播和對蝦免疫保護方面取得了豐碩的研究成果,但在防控技術(shù)上未能獲得理想的防治效果。本實驗旨在調(diào)查了解養(yǎng)殖凡納濱對蝦WSSV檢出率和發(fā)病情況,應(yīng)用前期篩選的抗WSSV專用中草藥HD-3進行感染臨床試驗,通過統(tǒng)計分析對蝦死亡率和對蝦免疫酶活數(shù)據(jù),結(jié)合熒光定量PCR、組織病理學(xué)檢測和超微病理學(xué)檢測,確定投喂中草藥的最佳預(yù)防方案,并開展中試試驗檢驗生產(chǎn)療效。1.在2014年7月-2015年12月,對遼寧、河北、天津、山東和浙江五省份,楊家泊、濱州、濰坊、膠南等環(huán)黃渤海凡納濱對蝦主產(chǎn)區(qū),共采集29批次樣品。每個養(yǎng)殖場樣品定義為同一批次,進行WSSV病原攜帶率和養(yǎng)殖工藝調(diào)查。通過DNA提取,利用套式PCR和熒光定量PCR診斷凡納濱對蝦的WSSV陽性率。結(jié)果顯示,在北方凡納濱對蝦主要產(chǎn)區(qū)通過套式PCR方法,WSSV陽性檢出率高達72.4%;通過熒光定量方法,WSSV檢出率達86.2%。熒光定量檢測方法敏感度在101copies/mg優(yōu)于套式PCR。傳統(tǒng)土塘養(yǎng)殖工藝凡納濱對蝦WSSV檢出率和感染程度高于大棚養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖模式。2.基礎(chǔ)飼料添加3%HD-3復(fù)方中草藥做藥餌,每天2次投喂量占對蝦體重5%,水體溫度25~28℃,鹽度18~20‰,溶解氧6.5mg/L以上。投喂1d、4d、7d、10d、13d、16d和19d藥餌后進行口服WSSV毒餌感染方式攻毒,統(tǒng)計對蝦癥狀表現(xiàn)和死亡率,測定對蝦酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)四種免疫因子。結(jié)果顯示:在飼料中添加HD-3中草藥,可以起到保護對蝦的作用,預(yù)防13d、16d和19d在試驗結(jié)束后仍有存活對蝦,其中實驗組16d獲得最高的免疫保護率,達到36.7±3.3%,存活者健康與空白對照組對蝦無異。服用HD-3 10d以后,可以顯著提高對蝦PO、SO D和AKP活力(P0.05),緩慢提升ACP活力(P0.05)。攻毒后服用較長時間中草藥的實驗組對蝦,PO、SOD、AKP和ACP活力可以獲得更持久的免疫活性。3.通過熒光定量對陽性對照組和各實驗組不同感染時期凡納濱對蝦腮組織內(nèi)病毒進行定量分析,顯示隨著服用中草藥時間的延長,對蝦體內(nèi)病毒增長幅度和最大峰值總體上低于陽性對照組。在感染72h后,陽性對照組病毒含量達到106 copies/mg峰值時,服用中草藥10d以后實驗組病毒含量顯著小于陽性對照組(P0.05),仍在104 copies/mg數(shù)量級。而存活對蝦體內(nèi)病毒含量整體較低,處于103 copies/mg數(shù)量級以下。通過組織病理觀察統(tǒng)計細胞核腫大程度(SOI),發(fā)現(xiàn)SOI與WSSV感染程度成正比,在腮組織和胃組織內(nèi),實驗組10d-19d在感染后SOI整體上低于陽性對照組,表現(xiàn)出良好的保護率。并且攻毒后存活對蝦SOI大多處于中度感染以下。在超微組織病理分析中,陽性對照組中,腮、胃和甲殼下表皮中受WSSV感染細胞數(shù)目和完整WSSV病毒含量明顯多于用藥組的存活對蝦。在用藥組中對蝦病毒形態(tài)多表現(xiàn)為大多數(shù)細胞完整,有稀疏、少量的病毒粒子存在,囊膜和核衣殼組裝多數(shù)不完整,亞細胞器諸如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等較清晰完整。超微電鏡觀察結(jié)果與熒光定量和SOI結(jié)果相符,推測該中草藥HD-3對阻斷WSSV侵染和細胞內(nèi)增殖有顯著效果。4.將抗WSSV中草藥HD-3在WSSV陽性檢出的對蝦養(yǎng)殖場進行中試試驗,試驗周期28天。經(jīng)過整個養(yǎng)殖周期,對蝦沒有爆發(fā)白斑綜合征,由統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析顯示,抗WSSV中草藥實驗組顯著提高了對蝦的增重率和成活率(P0.05)。添加中草藥可以在一定程度上提高對蝦免疫活力,尤其在高溫期,PO和ACP顯著高于對照組。通過定量PCR,顯示中草藥對WSSV有減緩增殖的趨勢。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S945.4
【部分圖文】：

驗方法查采樣方法 年 7 月~2015 年 12 月期間，對遼寧、河北、天津、山東、江濱對蝦養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)成期的對蝦進行樣品采集，總共 29 個樣品（養(yǎng)殖池塘、簡易養(yǎng)殖大棚、工廠化養(yǎng)殖車間等養(yǎng)殖模式。樣個樣品 10-30 頭，充氧運輸至青島中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水以供對蝦外觀病癥分析、提取 DNA 之用。定義每次采樣中一本，混合 10 尾蝦的腮組織保存在液氮中備用。

2.2.1 對蝦 WSSV 陽性檢測經(jīng)過對樣品進行套式 PCR 發(fā)現(xiàn)，在一擴條帶中，由圖 2-2 和陽性對照中有明顯的 1447bp 特異性條帶，而其他樣品和陰性對照中沒有出現(xiàn)條帶。說明 B1、F1、G3 受 WSSV 感染，而且感染程度較高。以第一次擴增產(chǎn)物為模板進行第二次擴增 PCR，由圖 2-3 顯示，A1、B1、B3、B4、C1、C2、E1、E2、F1、F2、F3、F5、F6、G1、G3、I1、J1、K1、K2、K4 和 M1 對蝦基因組可以擴增出 941bp 的特異性片段。說明這些樣品也是 WSSV 感染體，但是感染程度不大，處于較弱感染狀態(tài)。圖 2-4 顯示，各樣品和陽性樣品都擴增出 848bp 的片段，且陰性對照沒有條帶，陽性對照條帶明顯，說明各樣品都是有效的。B2、D1、F4、G2、G4、H1、K3、L1 在一擴和二擴 PCR 產(chǎn)物中無特異性條帶，表現(xiàn)為陰性。

2.2.1 對蝦 WSSV 陽性檢測經(jīng)過對樣品進行套式 PCR 發(fā)現(xiàn)，在一擴條帶中，由圖 2-2 和陽性對照中有明顯的 1447bp 特異性條帶，而其他樣品和陰性對照中沒有出現(xiàn)條帶。說明 B1、F1、G3 受 WSSV 感染，而且感染程度較高。以第一次擴增產(chǎn)物為模板進行第二次擴增 PCR，由圖 2-3 顯示，A1、B1、B3、B4、C1、C2、E1、E2、F1、F2、F3、F5、F6、G1、G3、I1、J1、K1、K2、K4 和 M1 對蝦基因組可以擴增出 941bp 的特異性片段。說明這些樣品也是 WSSV 感染體，但是感染程度不大，處于較弱感染狀態(tài)。圖 2-4 顯示，各樣品和陽性樣品都擴增出 848bp 的片段，且陰性對照沒有條帶，陽性對照條帶明顯，說明各樣品都是有效的。B2、D1、F4、G2、G4、H1、K3、L1 在一擴和二擴 PCR 產(chǎn)物中無特異性條帶，表現(xiàn)為陰性。
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本文編號：2850158