多倍體化是物種進化的重要特征。遠緣雜交是將一個物種的基因組轉(zhuǎn)移到另一個物種中的有效方法,從而使得雜交后代在表型上顯示出雜種優(yōu)勢以及在基因型上形成多倍體。在紅鯽(Carassius,auratus red var.,RCC,♀)和鯉魚(Cyprinuscarpio,CC,3)之間遠緣雜交產(chǎn)生的F2代中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了不減數(shù)的二倍體配子,運用人工方法將F2代進行自交得到了異源四倍體鯽鯉(4nAT),目前已獲得遺傳穩(wěn)定的兩性可育的異源四倍體魚品系(F3-F27)。本實驗室通過改良紅鯽和改良異源四倍體鯽鯉進行雜交得到了不育三倍體湘云鯽2號。三倍體魚的精巢正常發(fā)育但是卻沒有正常的精子產(chǎn)生,由于三倍體魚的性腺敗育,具有在任何水域進行養(yǎng)殖都不會對自然界中的種質(zhì)資源造成影響的特點而在中國被廣泛養(yǎng)殖。Dnah3與精子的鞭毛組裝、鞭毛的運動以及精子的活動有關(guān)。Ift57對維持鞭毛的長度和雙向物質(zhì)運輸是不可或缺的,這兩個基因的異常突變都會導(dǎo)致精子鞭毛發(fā)生異常,進而無法產(chǎn)生正常精子而敗育。本小組在前期的研究中已成功構(gòu)建了不同倍性鯽鯉精巢中的miRNAs文庫,通過對miRNA的靶基因進行預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)Dnah3和Ift57分別是miR-199-5p和miR-221的靶基因,在本研究中對Dnah3基因和If57基因的部分cDNA序列進行了克隆,并對這兩個基因在不同倍性鯽鯉組織中進行了半定量表達分析以及在精巢組織中進行了定量研究分析。microRNAs(miRNAs)是真核生物內(nèi)一類基因長度大約為17-24nt內(nèi)源性的非編碼小分子RNA。miRNAs通過與其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)完全或是不完全互補配對的方式對基因進行表達調(diào)控。越來越多的研究表明,miRNA與器官的形成、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生以及細胞的增殖、分化、凋亡等均有密切的關(guān)系。在本文中,我們構(gòu)建了紅鯽和異源四倍體鯽鯉卵巢的miRNAs文庫,且在多個方面對文庫進行了生物信息學(xué)分析并通過相關(guān)實驗對所得測序數(shù)據(jù)進行驗證。1.克隆并分析了Dnah3基因在二倍體紅鯽、異源三倍體鯽和異源四倍體鯽鯉中的部分cDNA序列,并對其進行了不同倍性鯽鯉9種組織中的差異性表達分析和研究,結(jié)果表明在精巢中的表達量高于其他組織。通過qPCR研究基因在不同倍性鯽鯉精巢中的表達。qPCR結(jié)果顯示在不育三倍體魚中的表達量比在可育二倍體魚和四倍體魚中低。2.克隆并分析了If57基因在二倍體紅鯽、異源三倍體鯽和異源四倍體鯽鯉中的部分cDNA序列,并對其進行了不同倍性鯽鯉9種組織中的差異性表達分析和研究,結(jié)果表明在精巢中的表達量高于其他組織。通過qPCR研究基因在不同倍性鯽鯉精巢中的表達,qPCR結(jié)果顯示不育三倍體魚中的表達量比在可育的二倍體魚和四倍體魚中低。3.分別取紅鯽和異源四倍體鯽鯉各三條卵巢組織樣本,提取RNA后進行高通量測序,對數(shù)據(jù)篩選后得到的clean reads分別為:1,252,130條(HJ1♀)、13,885,093條(HJ2♀f)、10,318,700條(HJ♀f)、12,888,037條(4nl♀f)、13,012,243條(4n2♀f)、11,342,865條(4n早f)。利用MIRDeep2軟件將miRNA序列mapped到參考基因組上,結(jié)果顯示,在二倍體紅鯽中有441條成熟的miRNAs序列;在異源四倍體鯽鯉中共有418條miRNAs序列。經(jīng)Illumina HiSeq 2500測序平臺分析發(fā)現(xiàn),相對二倍體在4nAT中有9條保守miRNAs表達下調(diào),30條保守miRNAs和4條非保守miRNAs是表達上調(diào)。基于高通量測序的結(jié)果,我們選取了五個在不同倍性魚類卵巢中差異表達的miRNAs(miR-6843-3p,miR-8lb-p,miR-42-5p,miR-21-5p,and miR-2368-3p),通過qRT-PCR驗證其相對表達水平。qRT-PCR結(jié)果與高通量測序的結(jié)果一致。然后我們將具有明顯表達差異的miRNA在miRanda數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)基因序列進行預(yù)測,與NR、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對后,對目標(biāo)基因進行功能注釋和分類。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

選擇及其影響因素還不是很確定，推測這可能由特定的ｍｉＲＮＡ和靶基因，或是??特定的組織和細胞來決定，也可能受控于不同的信號通路。下圖為ｍｉＲＮＡ的兩??種作用于靶ＲＮＡ的方式（圖１－１）?［５４】。??７??

環(huán)閾值（ＣＴ）并進行繪圖表達。??２．２．５．３實驗結(jié)果和分析??用ｑＰＣＲ的實驗方法，運用２－ＡＡＣ：ｔ方法計算并作圖得到如圖２－１的表達量圖??譜。??１０????８?－??５Ｃｌ—?Ｉ??ｔｅｓｔｉｓ－ｄｎａｆ＞３??■■■■■?２ｎ?＿Ｘ?Ｄａｔａ??Ｉ?ｔ?３ｒｉ??此■滅４ｎ??圖２－ｌ?基因在不同倍性鯽鯉中的表達量??Ｆｉｇ．２－ｌ?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｄｎａｈ３?ｇｅｎｅ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｌｏｉｄｙ?Ｃｙｐｒｉｎｉｄｓ??注：２ｎ：二倍體紅鯽（ＲＣＣ）?；?３ｎ：異源三倍體鯽魚；４ｎ：異源四倍體鯽鯉（４ｎＡＴ）??用不同倍性鯽鯉的精巢組織進行的實時熒光定量ＰＣＲ驗證，實驗結(jié)果顯示，??在異源三倍體鯽鯉中基因的表達量相對于二倍體紅鯽和異源四倍體鯽鯉??中的表達量下調(diào)。??２．２．６Ｚ）；７ｆｌＡ３基因在不同組織部位的表達??在克隆獲得基因的部分序列后，提取不同倍性鯽鯉的腦、心臟、腎臟、??肝臟、肌肉、卵巢、垂體、脾臟、精巢這９個組織的總ＲＮＡ，實驗步驟見２．２．１。??然后將其分別反轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ，實驗方法見２．２．２。用半定量ＲＴ－ＰＣＲ的實驗方法研??宄該基因在紅鯽，異源三倍體鯽魚以及在異源四倍體鯽鯉的９種不同組織中的表??達，反應(yīng)體系如下表（表２－８）。??１８??

加
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

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本文編號：2847235