卵黃抑制激素(vitellogenesis-inhibiting hormone,VIH)是甲殼動(dòng)物高血糖激素家族特有的成員之一,作為一種重要的神經(jīng)肽激素,在調(diào)控甲殼動(dòng)物卵黃蛋白原的生成過程中起到關(guān)鍵的作用。本研究是在課題組已有的部分VIH基因片段的基礎(chǔ)上,通過Genome walker、Tail-PCR和常規(guī)PCR等技術(shù)克隆獲得該基因的cDNA全長(zhǎng)和基因組DNA序列以及5’調(diào)控區(qū)序列。并結(jié)合體外重組表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等方法,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯水平揭示VIH的結(jié)構(gòu)特征和本身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1)采用Genome walker技術(shù)克隆出SpVIH基因的cDNA全長(zhǎng)634 bp,開放閱讀框(open reading frame,ORF)為375 bp,可編碼125個(gè)氨基酸,包括信號(hào)肽(1-22aa)和成熟肽兩部分。成熟肽包括CHH家族中6個(gè)位置較為保守的半胱氨酸(Cys)殘基,同時(shí)在成熟肽第12位有CHH家族II型肽特有的Gly~(12)。同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析均表明,SpVIH屬于CHH家族II型肽。空間結(jié)構(gòu)分析表明,其與南美白對(duì)蝦(LvVIH)的空間結(jié)構(gòu)高度相似,由5個(gè)α螺旋和多個(gè)無規(guī)則卷曲組成。2)采用常規(guī)PCR技術(shù)首次克隆出SpVIH基因的gDNA全長(zhǎng)790 bp,由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成,外顯子和內(nèi)含子均位于ORF內(nèi),內(nèi)含子在SpVIH成熟肽Arg(AGG)和Arg(AGG)的密碼子之間。其內(nèi)含子和外顯子之間并不遵循典型的“GT-AG”或“AT-AC”規(guī)則。3)通過原核表達(dá)技術(shù)對(duì)SpVIH的成熟肽部分進(jìn)行體外重組表達(dá),在29 kDa和31 kDa左右同時(shí)出現(xiàn)兩條蛋白條帶。經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析顯示,上下兩種蛋白測(cè)出的肽段序列與已知蛋白序列的覆蓋率分別為57.8%和61.8%,均認(rèn)為是目的條帶。同時(shí)對(duì)29 kDa左右的蛋白進(jìn)行鎳柱純化,并制備多克隆抗體。經(jīng)western blot驗(yàn)證后,發(fā)現(xiàn)該抗體能特異地和這兩個(gè)大小不一的蛋白結(jié)合。4)通過Genome walker和Tail-PCR聯(lián)用技術(shù)克隆獲得VIH基因的5’上游調(diào)控區(qū)序列,從翻譯起始位點(diǎn)(ATG)起,共3070 bp,從預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A)起,共2398 bp。CpG島預(yù)測(cè)軟件分析其不含CpG島。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件和啟動(dòng)子活性分析表明,其核心啟動(dòng)子區(qū)位于-203 bp—+213 bp之間,包含在線軟件預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A)上游-28 bp處存在TATA box。將pSpVIH-1(含核心啟動(dòng)子區(qū))重組至轉(zhuǎn)基因載體pEGFP-1上,在HEK293FT細(xì)胞中能驅(qū)動(dòng)EGFP的表達(dá)。5)不同長(zhǎng)度缺失片段啟動(dòng)子活性分析表明,在pSpVIH-4和pSpVIH-6之間可能同時(shí)存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)該區(qū)域預(yù)測(cè)的Sox9結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)突變和活性分析,發(fā)現(xiàn)突變?cè)撐稽c(diǎn)其活性發(fā)生顯著性降低(p0.05),表明Sox9可能是正調(diào)控?cái)M穴青蟹VIH基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。
【學(xué)位單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q78;S917.4
【部分圖文】：

圖 3.4 SpVIH 的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析所用 CHH 氨基酸序列的物種名和相應(yīng)的登錄號(hào)分別為：擬穴青蟹（Scylla paramamosain）CHH， AFM35652.1； 藍(lán)蟹（Callinectes sapidus）CHH2，ACH85179.1；羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii） CHH，AF372657_1；三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）CHH，ACB46189.1；日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）CHH，BAE78493.1；普通濱蟹（Carcinus maenas）CHH，AF286094_1；南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）CHH-B，AAN86057.1；歐洲龍蝦（Homarusgammarus）CHH-B，ABA42180.1；斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）CHH1，AAQ24525.1；美洲海螯蝦（Homarus americanus）CHH-A，AAB32871.1；云斑厚紋蟹（Pachygrapsus marmoratus）CHH，AAM21927.1； 刀額新對(duì)蝦（Metapenaeus ensis）CHH，BAJ23164.1。 所用 VIH/GIH 氨基酸序列信息如圖 3.4 注釋。 擬穴青蟹 SpVIH 用紅色菱形（ ）標(biāo)注，節(jié)點(diǎn)數(shù)字代表置信度，樹枝長(zhǎng)度代表遺傳距離。3.5 SpVIH 空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)利用 SWISS-MODEL 在線同源建模方法和三維結(jié)構(gòu)模型查看軟件 PyMOL，分別對(duì)SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空間三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。結(jié)果顯示 SpVIH 由 5 個(gè)α螺旋和多個(gè)無規(guī)則卷曲組成（圖 A），與 LvVIH 的空間結(jié)構(gòu)（圖 B）極其相似。去除 SpVIH 成熟肽12

圖 3.5 SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空間三維結(jié)構(gòu)的模擬A：SpVIH 的空間三維結(jié)構(gòu)； B：LvVIH 的空間三維結(jié)構(gòu)；C：去除成熟肽 Gly12 后 SpVIH 的空間三維結(jié)構(gòu)；D：SpCHH1 的空間三維結(jié)構(gòu)。3.6 原核表達(dá)3.6.1 含酶切位點(diǎn)目的片段的獲得以擬穴青蟹眼柄逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA第一條鏈為模板，根據(jù)SpVIH基因的ORF（去除信號(hào)肽后對(duì)應(yīng)的核苷酸序列）序列分別設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得300 bp左右的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3.6）。將目的條帶進(jìn)行割膠回收并測(cè)序后，最終得到324 bp的基因序列（包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列），且與已知序列完全一致。

肽后對(duì)應(yīng)的核苷酸序列）序列分別設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得300 bp左右的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3.6）。將目的條帶進(jìn)行割膠回收并測(cè)序后，最終得到324 bp的基因序列（包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列），且與已知序列完全一致。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2845933