擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)是一種嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的病原菌,可引起養(yǎng)殖魚類的腹水病。從蛋白質(zhì)組學(xué)角度研究擬態(tài)弧菌的分子致病機(jī)制,可為防治魚類腹水病提供新的模式。我們前期研究已證實(shí)腸黏膜組織是擬態(tài)弧菌黏附定植與生長繁殖的靶組織,亦探明外膜蛋白U(Outer membrance protein U,OmpU)是該菌的重要黏附素,但是OmpU蛋白在腸黏膜組織中的互作蛋白尚不清楚,擬態(tài)弧菌致病的分子調(diào)控機(jī)制也未明晰。對此,本課題利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對擬態(tài)弧菌感染前后草金魚腸黏膜組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組研究,為揭示擬態(tài)弧菌的分子致病機(jī)制,研發(fā)新型抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。本課題具體開展了以下研究工作:1草金魚感染模型的建立用濃度為1.15×10~(10)CFU/mL的擬態(tài)弧菌04-14分離株菌液以浸泡和腹腔注射方式感染草金魚,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射后12h,實(shí)驗(yàn)魚開始發(fā)病、死亡;而浸泡感染的實(shí)驗(yàn)魚未發(fā)生全部死亡,由此確定最佳感染途徑為腹腔注射。用4個(gè)不同感染劑量的菌液(3.45×109CFU/尾、2.32×109CFU/尾、1.75×109CFU/尾和1.14×109CFU/尾)腹腔注射實(shí)驗(yàn)魚,結(jié)果顯示3.45×109CFU/尾感染組實(shí)驗(yàn)魚在12h開始發(fā)病,隨后全部死亡,而其它組實(shí)驗(yàn)魚未全部死亡,說明擬態(tài)弧菌腹腔注射感染草金魚的最小致死量3.45×109CFU/尾。2腸黏膜組織蛋白提取方法的確定分別采用NP-40裂解法、含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解法和丙酮沉淀法提取腸黏膜組織總蛋白,通過SDS-PAGE分析和蛋白濃度測定評價(jià)提取效果。結(jié)果顯示,三種提取方法所獲得的蛋白質(zhì)濃度分別為10.05mg/mL、11.81mg/mL和1.71mg/mL,以含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解法提取的蛋白濃度最高、條帶最多,確定該法為腸黏膜組織蛋白提取的最佳方法。3感染前后腸黏膜組織差異蛋白組分析以最小致死量擬態(tài)弧菌腹腔注射感染草金魚,分別取感染前和瀕死期實(shí)驗(yàn)魚腸黏膜組織,每一時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解法提取腸黏膜組織蛋白,然后利用2-D電泳分離腸黏膜組織蛋白,并使用PDQuest8.0分析2-D凝膠圖譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染前后共有12個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生明顯變化,其中6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)16倍,6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)4倍。將12個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MOLDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定,共鑒定出12種蛋白,分別為肌凝蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白變異體A1、α肌動蛋白、載脂蛋白A-I、過氧化物酶、淀粉酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶前體、轉(zhuǎn)鐵蛋白變異體A、β-肌動蛋白、銅鋅超氧化物歧化酶和胃調(diào)蛋白。GO功能注釋分析、Pathway通路分析和STRING分析表明,這些蛋白存在直接或間接互作關(guān)系,參與9個(gè)生物學(xué)過程,涉及9個(gè)信號傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞結(jié)構(gòu)組建、免疫、抗氧化和能量代謝等方面發(fā)揮重要作用。4 OmpU互作蛋白的篩選與鑒定按常規(guī)的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化方法,制備His-OmpU融合蛋白。以His-OmpU蛋白為誘餌蛋白,腸黏膜組織蛋白為獵物蛋白,用His-tag pull down試劑盒篩選腸黏膜組織蛋白中OmpU互作蛋白。SDS-PAGE分析顯示,與誘餌蛋白對照組和獵物蛋白對照組比較,Pull down試驗(yàn)組出現(xiàn)了5條明顯的差異蛋白條帶。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜鑒定,5條差異蛋白條帶分別對應(yīng)細(xì)絲蛋白A、α-肌動蛋白2、調(diào)寧蛋白2、α-輔肌動蛋白4和轉(zhuǎn)膠蛋白。GO功能注釋分析表明5個(gè)互作蛋白分為二類,一類為細(xì)胞骨架蛋白(α-肌動蛋白2),另一類為細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白(細(xì)絲蛋白A、α-輔肌動蛋白4、轉(zhuǎn)膠蛋白2和調(diào)寧蛋白2)。它們除了參與許多重要的細(xì)胞活動外,在病原菌的黏附、內(nèi)化和致病過程中也發(fā)揮重要作用。綜上所述,本研究探明了擬態(tài)弧菌感染前后魚腸黏膜組織蛋白質(zhì)組差異表達(dá)模式,初步鑒定OmpU黏附素的互作蛋白。為揭示擬態(tài)弧菌的分子致病機(jī)制,研發(fā)新型抗菌制劑奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S941.4
【部分圖文】：

動、腹部輕微腫大等癥狀；12h 后實(shí)驗(yàn)魚張嘴呼吸、精潰爛出血、身體失去平衡的游動；24h 后實(shí)驗(yàn)魚發(fā)生死、肝脾出血、部分肝臟液化（圖 2-1）。病過程，取感染前與感染后 12h（瀕死期）各 3 尾，采成粉末狀，-80℃保存，用于后續(xù)檢測。

同時(shí)使用改良型 BCA 法蛋黏膜組織總蛋白分別為 10.05mg/m抑制劑的 NP-40 裂解法）和 1.71mg/的 NP-40 裂解法提取效果最好。M 1 2 3 4

從感染前后腸黏膜組織總蛋白雙向凝膠圖譜中分別檢測到238和216個(gè)，蛋白匹配率為87%。感染前后比較得到12個(gè)差異蛋白，其中6個(gè)點(diǎn)蛋白表達(dá)上圖2-3中1-6，上調(diào)16倍），6個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)（圖2-3中7-12, 下調(diào)4倍。）pH 310 pH 3 1031
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本文編號：2844899