發(fā)布時間：2020-10-15 05:03

　　 長江鱘(Acipenser dabryanus)是國家一級極度瀕危保護動物。近幾年雖然長江鱘的人工繁,養(yǎng)殖都取得很大的成功,但是每年都會出現(xiàn)因疾病造成很大損失的情況,因此,免疫防治成為解決該問題的重要切入點。本研究根據(jù)長江鱘轉(zhuǎn)錄組相關信息,挑選出SIGIRR(Single Ig IL-1R–related molecule)、TRAF6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)、Mx(Myxovirus resistance)、Viperin(virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum-associated,interferon-inducible)、PKR(Double-stranded RNA-dependent protein kinase)及ADAR(Adenosine deaminase acting on RNA)六個干擾素信號通路中的基因進行研究。在本研究中,我們分別克隆了SIGIRR、TRAF6、Mx、Viperin、PKR及三個ADAR亞型(ADAR1-1,ADAR1-2和ADAR4)基因的cDNA序列,并利用qPCR技術檢測這些基因在組織中的表達模式和經(jīng)Poly(I:C)(polyinosinic-polycytidylic acid)誘導后的表達變化。所有結(jié)果如下:(1)長江鱘SIGIRR和TRAF6基因的開放閱讀框(ORF)長度分別為1641 bp和1668 bp,分別編碼546和555個氨基酸。預測的SIGIRR蛋白質(zhì)的分子量約為58.86 KDa;理論等電點為5.09;不穩(wěn)定指數(shù)為46.64,為不穩(wěn)定蛋白。而TRAF6的蛋白分子量為62.54 KDa;理論等電點5.64;不穩(wěn)定指數(shù)61.60,也是不穩(wěn)定蛋白。長江鱘SIGIRR和TRAF6蛋白序列在相似性上,與小體鱘(Acipenser ruthenus)最為相似,分別具有97.70%和98.37%的相似性。長江鱘SIGIRR的蛋白結(jié)構(gòu)具有兩個Ig結(jié)構(gòu)和一個TIR結(jié)構(gòu)域,這與小體鱘的同源基因蛋白結(jié)構(gòu)域非常的一致,而TRAF6與其他物種的同源基因蛋白結(jié)構(gòu)域保持高度一致。此外,長江鱘SIGIRR基因含有9個外顯子和8個內(nèi)含子,在不同物種之間通有4個相同大小的外顯子,而TRAF6包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。SIGIRR和TRAF6在所有檢測的組織中都有表達,其中SIGIRR在腸表達最高,在血液表達最低;TRAF6在頭腎表達最高,其次是腸,在血液里最低。在使用Poly(I:C)進行模擬感染長江鱘鰭條細胞后,長江鱘SIGIRR在3 h時的表達顯著下調(diào)(P0.01),在6 h上升恢復到正常水平;長江鱘TRAF6在6 h至24 h持續(xù)顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明長江鱘SIGIRR和TRAF6可能在長江鱘病毒誘導的TLR信號傳導途徑中起重要的作用。(2)長江鱘Mx基因序列含有1449 bp長度的ORF,其編碼482個氨基酸,以及123 bp的5'非翻譯區(qū)(UTR)和不完全測序的3'。而Viperin和PKR基因的ORF長度分別為1050 bp和1221 bp,分別編碼349和406個氨基酸。雖然長江鱘Mx和其他動物Mx蛋白之間的相似性很低,但長江鱘Mx含有保守的三聯(lián)GTP結(jié)合基序和發(fā)動蛋白家族特征。蛋白序列的相似性以及序列多重比較,表明長江鱘Viperin和PKR在物種中相對保守。此外,長江鱘Mx基因具有8個外顯子和7個內(nèi)含子;Viperin含有6個外顯子和5個內(nèi)含子,而PKR擁有13個外顯子和12個內(nèi)含子。在所有檢測的組織中都可檢測到Mx,Viperin,PKR及ADAR的表達,其分別在皮膚,血液,腦以及腸和皮膚中主要表達。在使用Poly(I:C)進行模擬感染長江鱘鰭條細胞后,Mx,Viperin和PKR在6 h至24 h持續(xù)顯著上調(diào)(P0.05),ADARs也顯著變化。這些結(jié)果表明,長江鱘Mx,Viperin,PKR和ADAR可能在長江鱘的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的抗病毒作用。
【學位單位】：長江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

1.2.2 魚類干擾素信號通路IFN 系統(tǒng)激活的前提是外界的病原微生物與靶細胞的模式識別受體（PRRs，pattern recognition receptors）結(jié)合并發(fā)生信號轉(zhuǎn)導。TLRs（Toll-like receptors）和RLRs（RIG-I-like receptors）都屬于 PRRs。在魚類中發(fā)現(xiàn)了多樣化的 TLR 序列[51,52]。一些 TLR 僅在低等脊椎動物中被描述，包括 TLR14 和 TLR23; TLR18， TLR19和 TLR20 ; TLR21 和 TLR22; TLR24，TLR25 及 TLR26[51,53,54]。TLRs 在哺乳動物中參與識別雙鏈 RNA (dsRNA) (TLR3)或單鏈 RNA (TLR7 和 8)，在魚類中具有良好的同源性[55]。結(jié)構(gòu)和功能分析均表明這些 TLR 也參與魚類的病毒感染：所有與dsRNA 結(jié)合的關鍵殘基在魚類 TLR3 中都是保守的[54]，同樣，富含亮氨酸的 TLR7重復序列在哺乳動物和魚類之間非常保守[54,56]，TLR7 和 TLR8（R-848）的已知配體誘導鮭魚（Salmonidae）白細胞中典型的 IFN 反應[57,58]。此外，在魚類特異性 TLR中，TLR22 對病毒感染，poly（I:C）和 dsRNA 均有反應[59]。河豚（Takifugu rubripes）的 TLR22 可識別細胞表面的長鏈 dsRNA，而 TLR3 可識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的短鏈 dsRNA[59]，這可能是魚類 RNA 病毒感染的雙重途徑。

圖 1-2 白細胞介素-1 細胞因子家族成員信號通路[77]Fig.1-2 Signaling of IL-1 cytokine family members為 TRAF1 至 7[83]。其中，TRAF6 是 TRAF 家族中獨特且研究得很好的成員。在來自各種 PRR 和細胞因子受體（包括 TNF 超家族，TGFβ，IL-1/Toll 樣和 NOD 樣受體）的信號傳導途徑中，TRAF6 是必需的信號轉(zhuǎn)導分子[84-86]，而且在 MyD88 依賴性信號傳導中也是需要的[87]。在 NF-kB 途徑中，TRAF6 作為銜接信號分子，并激活 IκB 激酶（IKK）級聯(lián)觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子 NF-kB 的激活以響應促炎細胞因子[83]。此外，TRAF6 形成由 Ubc13 和 Uev1A 組成的泛素結(jié)合酶復合物，作為 E3 泛素連接酶，催化 TAK1 的 K63 多泛素化，這是 IKK 活化所必需的，并介導其他下游信號分子的激活，從而誘導 IRF7，IRF3 和 NF-κB 的組成性激活[88]。TRAF6 在響應水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）感染和 dsRNA，poly（I:C）的 IFN-α/β產(chǎn)生中表現(xiàn)出不足之處。TRAF6 還通過在感知細胞溶質(zhì)病毒 RNA 和 DNA 時激活NF-kB 和 IRF7 來建立先天免疫應答[89]。除 TRAF6 在先天免疫中的作用外，TRAF6還在適應性免疫中發(fā)揮功能。Pearce 等人對含有 T 細胞特異性 TRAF6 缺失的小鼠進行了研究，結(jié)果顯示由于缺乏 AMP 激活的激酶激活和生長因子耗盡后的線粒體

圖 2-5 長江鱘 SIGIRR 蛋白結(jié)構(gòu)域預測注：不同結(jié)構(gòu)域用不同顏色代表Fig.2-5 Prediction of SIGIRR protein domain in Dabry's sturgeon
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本文編號：2841736