溫度變化對魚類的多種生理活動有重要影響,溫度脅迫也與病害的大規(guī)模爆發(fā)密切相關(guān),從而影響魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。大黃魚是我國最重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類之一,環(huán)境溫度驟變與病害頻發(fā),嚴(yán)重制約了其健康發(fā)展。因此,從溫度和免疫兩個方面研究大黃魚應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激和病原侵染的反應(yīng)機制,對于提高大黃魚自身抗病能力具有重大意義。本研究克隆了大黃魚MAPK家族中JNK亞家族中的JNK1、JNK2、JNK3三個基因,p38基因,ERK亞家族中的ERK2基因和ERK5家族的ERK5基因的全長cDNA序列,并分析了它們的結(jié)構(gòu)特征;研究了它們在大黃魚不同組織的表達譜,以及10°C與35°C的溫度脅迫和病原分子模式刺激后,它們在LCK細胞系中的表達變化;觀察了其在LCK細胞系中的亞細胞定位;并深入分析了p38在大黃魚抵抗溫度脅迫過程中的角色。具體結(jié)果如下:(1)大黃魚JNK1基因全長cDNA為1970bp,其中開放閱讀框(open reading frame,ORF)長度為1335bp,編碼444個氨基酸;5’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)為249bp,3’UTR為386bp。預(yù)測分子量(molecular weight,Mw)大小為49.57kDa,等電點(isoelectric point,pI)為6.57。生物信息學(xué)預(yù)測JNK1包含一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域(Serine/Threonine protein kinases catalytic domain,S_TKc)和TPY雙磷酸化位點。JNK1基因在大黃魚的鰓中表達量最高,而在脾中表達量最低。多聚肌苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)和鞭毛蛋白(flagellin)刺激均可誘導(dǎo)JNK1在LCK細胞系中表達顯著增加(p0.05),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肽聚糖(peptidoglycan,PGN)則顯著抑制JNK1的激活(p0.01)。在10°C和35°C刺激的LCK細胞系中,溫度脅迫后JNK1的表達與對照組沒有顯著變化。JNK1基因在LCK細胞系中的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。推測大黃魚JNK1基因在poly I:C和鞭毛蛋白刺激的細胞信號通路中可能發(fā)揮作用。大黃魚JNK2序列包括193bp的5’端UTR,983 bp的3’端UTR和1260 bp的ORF,共編碼420個氨基酸,預(yù)測Mw為47.59kDa,pI約為5.07。JNK2含有MAPK家族特有的S_TKc和TPY雙磷酸化位點。JNK2基因在大黃魚的血液中的表達量最高,而在肌肉中表達量最低。LPS和PGN刺激均可誘導(dǎo)JNK2在LCK細胞系中上調(diào)表達(p0.01)。Poly I:C刺激后JNK2表達下調(diào)(p0.01)。鞭毛蛋白刺激對JNK2表達無顯著影響。溫度刺激LCK細胞系,JNK2基因的表達量無顯著性變化。JNK2基因在LCK細胞系中的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。結(jié)果表明JNK2可能在LPS和PGN刺激的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。大黃魚JNK3基因全長1669bp,包括一個122bp的5’UTR,126bp的3’UTR,以及1422bp的ORF,共編碼473個氨基酸,預(yù)測Mw為53.63kDa,PI約為6.86。JNK3含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域(S_TKc)和TPY雙磷酸化位點。JNK3基因主要在腦中的表達量較高,而在肝中表達量最低。Poly I:C和鞭毛蛋白刺激均可誘導(dǎo)JNK3在LCK細胞系中表達(p0.01)。LPS和PGN刺激JNK3其表達量與對照組相比會下調(diào)。在10°C刺激LCK細胞系中,JNK3的表達趨勢輕微上調(diào)(p0.05)。高溫刺激對JNK3的表達無顯著變化。JNK3基因在LCK細胞系中的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。結(jié)果表明,JNK3可能在Poly I:C和鞭毛蛋白誘導(dǎo)的生理反應(yīng)中發(fā)揮作用。(2)p38全長cDNA序列1716bp,5’UTR為143bp,3’UTR為488bp,其中ORF為1086bp,共編碼361個氨基酸,預(yù)測Mw為41.67 kDa,PI為5.4。大黃魚p38的氨基酸含有保守的TGY基序,并且具有谷氨酸/天冬氨酸位點(ED site)和底物結(jié)合位點(ATRW)和S_TKc。p38基因在大黃魚的各個組織中廣泛表達,其中在小腸中表達量最高。LPS、PGN、Poly I:C和鞭毛蛋白均可誘導(dǎo)p38轉(zhuǎn)錄水平表達上調(diào)(p0.01)。10°C和35°C刺激激可增加p38在mRNA水平的表達量(p0.01)。p38基因在LCK細胞系中的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。低溫和高溫刺激均可誘導(dǎo)p38在蛋白水平的磷酸化,并隨著時間推移,其磷酸化程度增加(p0.01)。在低溫和高溫刺激的LCK細胞系中,p38磷酸化抑制劑可顯著抑制p38的磷酸化水平(p0.05)。Hsp27的轉(zhuǎn)錄水平在低溫刺激的LCK細胞系中表達量上調(diào)(p0.01),受到抑制劑處理后,其在轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(p0.05)。經(jīng)高溫誘導(dǎo)和抑制劑處理后,發(fā)現(xiàn)Hsp27在轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)(p0.05),并不受抑制。在10°C和35°C刺激及抑制劑處理的LCK細胞系中,10°C和35°C處理可使得Caspase3在轉(zhuǎn)錄水平的表達上調(diào),經(jīng)抑制劑處理后,Caspase3的表達不受抑制。結(jié)果表明,病原刺激和溫度刺激均可激活p38,而抑制劑處理可有效抑制Hsp27在mRNA水平的表達,對Caspase3則無影響。(3)大黃魚ERK2基因全長cDNA序列為1910bp,5’UTR為143bp,3’UTR為658bp,ORF為1110bp,共編碼369個氨基酸。預(yù)測Mw為42.1kDa,PI為6.19。ERK2氨基酸中有S_TKc結(jié)構(gòu)域,HRD催化位點,TEY雙磷酸化位點及核定位信號SPS和甘氨酸富集區(qū)。大黃魚ERK2基因在腦中表達量最高,而在肝臟中表達量最低。Poly I:C和鞭毛蛋白刺激均可激活ERK2在LCK細胞系中表達(p0.05)。低溫可抑制ERK2在LCK細胞系中的激活(p0.01),高溫則可激活ERK2在LCK細胞系中的表達(p0.05)。ERK2基因在LCK細胞系中的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。結(jié)果表明,ERK2可能參與Poly I:C和鞭毛蛋白誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中。(4)大黃魚ERK5基因全長cDNA序列3720bp,5’UTR為103bp,3’UTR為264bp,ORF為3375bp,共編碼1124個氨基酸。預(yù)測Mw為123.27kDa,PI為6.6。ERK5氨基酸中有S_TKc結(jié)構(gòu)域,HRD催化位點,TEY雙磷酸化位點及核定位信號NLS和MEK5結(jié)合位點。大黃魚ERK5基因在鰓中表達量最高,而在小腸中表達量最低。Poly I:C和鞭毛蛋白刺激均可誘導(dǎo)ERK5在LCK細胞系中的激活(p0.01)。高溫和低溫均可抑制ERK5在LCK細胞系中的表達(p0.01)。ERK5基因在LCK細胞系中的細胞核與細胞質(zhì)中均有表達。結(jié)果表明,ERK5可能參與到Poly I:C和鞭毛蛋白誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中。
【學(xué)位單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

鋪滿培養(yǎng)瓶后，將細胞傳代至 6 孔板養(yǎng) 4-6 h，pfectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑操作步驟， 1μg/μL 的 Hoechst 33342 稀釋液中，NK2、JNK3 全長 cDNA 克隆鰓、肝、頭腎總 RNA 抽提完畢后經(jīng) 28S 和 18S rRNA 清晰可見，表明 R

圖 2.2 大黃魚 JNK1 基因 ORF 驗證M:100bp DNA Ladder；1：鰓；2：腦 基因全長 cDNA 序列分析全長為 1970bp，其中開放閱讀框（ORF）為 131cDNA 編碼 444 個氨基酸，預(yù)測分子量大小為一個 RNA 不穩(wěn)定基序 ATTTA 結(jié)構(gòu)。 氨基酸序列分析結(jié)果分析顯示，JNK1 主要有一個結(jié)構(gòu)域，即 S_TK軟件 ESyPred3D 及 3D 模型查看軟件 RASMOL 2.3（b）所示。

圖 2.2 大黃魚 JNK1 基因 ORF 驗證M:100bp DNA Ladder；1：鰓；2：腦1 基因全長 cDNA 序列分析全長為 1970bp，其中開放閱讀框（ORF）為 131cDNA 編碼 444 個氨基酸，預(yù)測分子量大小為 一個 RNA 不穩(wěn)定基序 ATTTA 結(jié)構(gòu)。1 氨基酸序列分析結(jié)果分析顯示，JNK1 主要有一個結(jié)構(gòu)域，即 S_TKc軟件 ESyPred3D 及 3D 模型查看軟件 RASMOL 2.3（b）所示。
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本文編號：2840474