我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國,養(yǎng)殖規(guī)模位居世界前列。但目前的高密度集約化養(yǎng)殖使得病害發(fā)生日益頻繁,尤以細(xì)菌病最為嚴(yán)重,傳統(tǒng)的熒光抗體法、酶聯(lián)免疫分析法均存在背景熒光較高,靈敏度低等缺陷,時(shí)間分辨熒光免疫分析法作為一種高靈敏的檢測方法已在食品、化學(xué)等領(lǐng)域引起重視;課題組首次應(yīng)用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測了產(chǎn)酸克雷伯氏菌,我們?cè)诖嘶A(chǔ)上探索了TRFIA檢測致病菌的新方法,主要內(nèi)容如下:1.建立了雙標(biāo)記TRFIA檢測嗜水氣單胞菌B18和產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12,將致病菌直接包被微孔板,Eu3+-Ig G、Sm3+-Ig G作為檢測抗體對(duì)其進(jìn)行檢測,嗜水氣單胞菌B18和產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12檢測靈敏度均為1.0×106 cfu/m L,靈敏度較低存在很大的可拓展空間。2.為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度,將抗嗜水氣單胞菌B18抗體和抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12抗體包被微孔板,建立了嗜水氣單胞菌B18和產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12的雙抗夾心雙標(biāo)記TRFIA法,通過對(duì)包被Ig G、Eu3+-Ig G及Sm3+-Ig G進(jìn)行優(yōu)化產(chǎn)酸克雷伯氏菌B12的檢測限達(dá)到1.0×104 cfu/m L,嗜水氣單胞菌B27的檢測限為6.0×104 cfu/m L,標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.0×104-1.0×107cfu/m L范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)達(dá)99%以上,均優(yōu)于目前常用的熒光抗體法及ELISA法,且特異性好、重復(fù)性好、亦可用于實(shí)際樣品檢測。3.利用生物素標(biāo)記抗嗜水氣單胞菌抗體,堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素與其發(fā)生特異反應(yīng)后,先后加入反應(yīng)底物二氟苯水楊酸酯,在酶催化作用下,反應(yīng)產(chǎn)物能夠與Tb3+-EDTA生成時(shí)間分辨熒光溶液,以此建立的酶放大時(shí)間分辨熒光分析法檢測嗜水氣單胞菌B18。標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.0×102-1.0×106cfu/m L范圍內(nèi)線性良好,該方法的靈敏度為1.0×102cfu/m L,優(yōu)于雙抗夾心雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析法,且特異性好,重復(fù)性好,可用于實(shí)際樣品檢測。4.本課題組先期已合成出新型螯合劑DTPA-p AS,但直接與抗體標(biāo)記,靈敏度較低;本研究在此基礎(chǔ)上,通過多聚賴氨酸改進(jìn)標(biāo)記比,建立了檢測嗜水氣單胞菌B18的TRFIA法,靈敏度為1.0×105cfu/m L。
【學(xué)位單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S941
【部分圖文】：

學(xué)碩士學(xué)位論文 新型時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測水產(chǎn)26983。數(shù)據(jù)分析后，產(chǎn)酸克雷伯氏菌的板內(nèi)變異系數(shù)為 6.38%，板間變異；嗜水氣單胞菌的板內(nèi)變異系數(shù)為 5.84%，板間變異系數(shù)為 8.81%；板內(nèi)變變異系數(shù)均符合小于 15%的要求[100,101]，說明該方法具有高度可重復(fù)性，能測。

釋到 1×10cfu/mL）注入鰻鱺腹腔，每條鰻鱺注入 0.2mL，對(duì)照組理 15 天。15 天后選取無明顯發(fā)病癥狀以及略微有患病癥狀的鰻鱺鱺樣品均取其腸、肝、腎、鰓、肌肉等部位組織，置于-80℃冷藏備心雙標(biāo)記 TRFIA 對(duì)其進(jìn)行測定，分別取各部位組織 0.1g，置于 700漿、離心后，取各自上清液等體積混合后，實(shí)驗(yàn)組設(shè)兩組平行，注樣品作為對(duì)照組，免疫反應(yīng)后測定并記錄 TRF 值。與分析被抗體最適工作濃度示，當(dāng)包被抗體濃度小于 1 μg/mL，免疫反應(yīng)隨著包被抗體濃度的增等于 1 μg/mL ，TRF 值最大；包被抗體大于 1 μg/mL，TRF 值會(huì)出疫反應(yīng)飽和趨于平穩(wěn)。達(dá)到峰值后出現(xiàn)略微降低主要是因?yàn)?IgG 濃子出現(xiàn)多層化，彼此之間的相互作用會(huì)影響其與微孔板的吸附性，非特異性吸附以及空間位阻效應(yīng)。而抗體濃度過小也會(huì)導(dǎo)致免疫反上結(jié)果，將包被抗體的最適濃度確定為 1 μg/mL。

圖 3-2 Eu3+-IgG 的濃度對(duì)檢測信號(hào)的影響圖 3-3 Sm3+-IgG 的濃度對(duì)檢測信號(hào)的影響橫坐標(biāo)表示菌濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示時(shí)間分辨熒光的對(duì)數(shù)值，最佳稀釋度為 1∶1280橫坐標(biāo)表示菌濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示時(shí)間分辨熒光的對(duì)數(shù)值，最佳稀釋度為 1∶600
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2836580