櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類,其貝殼的形成過程與其生長(zhǎng)過程是密不可分的。本論文通過對(duì)櫛孔扇貝貝殼的礦化相關(guān)基因cf MSP-1的克隆、定位與功能研究,旨在進(jìn)一步探索櫛孔扇貝的生物礦化機(jī)制,對(duì)現(xiàn)有的生物礦化理論也具有重要意義。通過對(duì)櫛孔扇貝外套膜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,我們克隆了其表達(dá)量最高的cf MSP-1,通過RACE技術(shù)從外套膜組織中克隆獲得cf MSP-1基因的c DNA全長(zhǎng)。該基因全長(zhǎng)為2912 bp,包括一個(gè)74 bp的5’非編碼區(qū),一個(gè)2406 bp的開放閱讀框與一個(gè)432 bp的3’非編碼區(qū)。其編碼蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)分子量約為71.3 k Da,理論等電點(diǎn)為3.36,經(jīng)過信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析,其N端含有一個(gè)20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。對(duì)不同組織的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,cf MSP-1在外套膜組織中特異性表達(dá),通過原位雜交技術(shù)進(jìn)行精確定位,發(fā)現(xiàn)其在外套膜邊沿部的外褶和向外邊沿部分表達(dá),結(jié)合信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果,推測(cè)cf MSP-1可能由外套膜合成并分泌的基質(zhì)蛋白。貝殼缺刻損傷引起cf MSP-1基因的表達(dá)量迅速上調(diào),并且會(huì)持續(xù)保持在一個(gè)相對(duì)較高的表達(dá)水平。使用RNA干擾方法特異性敲低cf MSP-1基因的表達(dá)水平,同時(shí)通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察貝殼簇葉層的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)cf MSP-1在櫛孔扇貝貝殼簇葉層的形成中起關(guān)鍵作用。
【學(xué)位單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 生物礦化
        1.1.1 生物礦化的定義
        1.1.2 生物礦物
        1.1.3 生物礦化機(jī)制
    1.2 軟體動(dòng)物生物礦化
        1.2.1 軟體動(dòng)物貝殼
        1.2.2 常見貝殼碳酸鈣晶體結(jié)構(gòu)
    1.3 軟體動(dòng)物貝殼基質(zhì)蛋白研究
        1.3.1 軟體動(dòng)物貝殼基質(zhì)蛋白研究方式
        1.3.2 軟體動(dòng)物貝殼基質(zhì)蛋白的特征
        1.3.3 MSP-1 的研究進(jìn)展
    1.4 櫛孔扇貝
        1.4.1 櫛孔扇貝簡(jiǎn)介
        1.4.2 櫛孔扇貝貝殼的結(jié)構(gòu)
        1.4.3 櫛孔扇貝生物礦化研究
    1.5 研究目的與意義
    1.6 論文各部分主要內(nèi)容
第2章 基質(zhì)蛋白cfMSP-1 的克隆與基因序列分析
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 外套膜總RNA的提取
        2.2.2 cfMSP-1 開放閱讀框的獲得和序列確定
        2.2.3 cfMSP-1 的cDNA末端快速擴(kuò)增
        2.2.4 生物信息學(xué)分析cfMSP-1 基因
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 櫛孔扇貝的外套膜總RNA的完整性
        2.3.2 櫛孔扇貝外套膜cDNA文庫建立以及cfMSP-1 基因克隆
        2.3.3 cfMSP-1 cDNA序列全長(zhǎng)的獲得
        2.3.4 cfMSP-1 基因序列分析
        2.3.5 cfMSP-1 氨基酸序列分析
    2.4 討論
        2.4.1 櫛孔扇貝cfMSP-1 基因的克隆
        2.4.2 cfMSP-1 基因序列特征
第3章 基質(zhì)蛋白cfMSP-1 的功能研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 利用RT-PCR分析cfMSP-1 組織表達(dá)特征
        3.2.2 原位雜交定位cfMSP-1 的精確表達(dá)位置
        3.2.3 貝殼修復(fù)損傷實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 RNAi實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 貝殼結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察
        3.2.6 櫛孔扇貝貝殼中基質(zhì)蛋白的提取
        3.2.7 體外表達(dá)cfMSP-1 重組蛋白
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 定位cfMSP-1 表達(dá)位置
        3.3.2 貝殼損傷后cfMSP-1 基因的相對(duì)表達(dá)量變化
        3.3.3 cfMSP-1 在貝殼形成過程中的作用
        3.3.4 櫛孔扇貝貝殼基質(zhì)蛋白的提取
        3.3.5 櫛孔扇貝cfMSP-1 重組蛋白表達(dá)
    3.4 討論
        3.4.1 cfMSP-1 在櫛孔扇貝各組織中的表達(dá)分布
        3.4.2 cfMSP-1 蛋白的生物功能研究
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

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