集約化養(yǎng)殖模式下,養(yǎng)殖魚類經(jīng)常出現(xiàn)肝脂代謝紊亂等問題。鯉是我國北方地區(qū)的主養(yǎng)經(jīng)濟魚類。近年來,由于養(yǎng)殖水體惡化、養(yǎng)殖密度過大等原因,鯉魚養(yǎng)殖中出現(xiàn)了脂肪過度蓄積等代謝紊亂現(xiàn)象。在眾多環(huán)境因子中,銅作為礦物營養(yǎng)素、除藻劑或病原菌抑制藥物常被過量應(yīng)用于飼料或水環(huán)境中,當其以自由金屬離子形式進入到環(huán)境中并達到一定濃度時,就會對魚類等水產(chǎn)動物產(chǎn)生毒害作用。本研究采用高通量測序技術(shù),探究水體銅暴露條件下鯉腸道微生物群落組成及多樣性變化,借助熒光定量技術(shù)檢測鯉肝胰臟脂代謝相關(guān)基因及腸道緊密結(jié)合蛋白基因表達量的變化,闡述“銅—腸道微生物—脂代謝”三者之間的互作關(guān)系,推測腸道微生物介導(dǎo)的銅致機體脂代謝異常的機制。研究結(jié)果可為深入揭示魚類肝脂代謝紊亂機制提供新的視角,為維持魚類腸道健康、提升水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖水平提供理論依據(jù)。1.水體銅暴露對鯉生長性能的影響及在鯉組織中的蓄積根據(jù)鯉Cu~(2+)半致死濃度(LC50=1.42 mg/L),本研究共設(shè)計1個對照組和3個處理組(濃度分別為0.00 mg/L、0.07 mg/L、0.14 mg/L、0.28 mg/L)。飼喂鯉56 d后,檢測鯉的生長指標,結(jié)果表明,與對照組相比,處理組的增重率(Weight gain rate,WGR,%)與特定生長率(Specific growth rate,SGR,%/day)均無顯著差異(P0.05)。但處理組之間差異顯著,即高濃度組的增重率和特定生長率顯著低于低濃度組(P0.05)。利用原子吸收光譜法檢測銅在鯉肝胰臟和腸道中的累積情況,可以看出,隨著處理濃度的增大,銅在鯉肝胰臟和腸道內(nèi)的累積倍增。用全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白(Total protein,TP)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)的含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)等的活性,結(jié)果顯示,在處理組之間,ALT、LDL、TG、IgG等指標出現(xiàn)顯著異常(P0.05)。2.熒光定量檢測鯉肝胰臟和腸道脂代謝相關(guān)基因的表達量采用實時熒光定量技術(shù)檢測了5種脂代謝相關(guān)基因的表達量,結(jié)果顯示,與對照組相比,高濃度組脂肪合成相關(guān)基因FAS、SREBP-1、ACC-1的表達量呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(P0.05),而脂肪分解相關(guān)基因LPL、CPT-1的表達量則呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(P0.05)。說明處理組脂肪合成減少,脂肪分解增多。同時,檢測腸道3種腸粘膜緊密結(jié)合蛋白基因Zo-1、Occludin和Claudin-3的表達量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,銅處理組Zo-1基因的表達量變化不顯著(P0.05),Occludin和Claudin-3基因的表達量出現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢(P0.05)。這預(yù)示著腸壁通透性增大,利于腸道內(nèi)代謝產(chǎn)物進入血液。機體內(nèi)存在腸-肝軸,正常情況下,腸粘膜可允許少量內(nèi)毒素(LPS)進入門靜脈,維持肝臟網(wǎng)狀內(nèi)系統(tǒng)處于激活狀態(tài)。如果腸粘膜屏障功能喪失,腸壁通透性就會增高,引起大量細菌和LPS易位,可能會造成肝臟的免疫功能受損,形成慢性肝損傷。3、高通量測序檢測腸道微生物群落組成及多樣性的變化采用Illumina HiSeqTM 2500測序平臺對樣品測序完成后,共得到原始序列838,774條。篩選過濾后,12個樣品共得到高質(zhì)量序列721,786條。分析得到29,951個OTU,每個OTU代表一個種系型,此結(jié)果說明樣品的總體物種多樣性水平較高。ACE值、Chaol值、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)結(jié)果顯示,水體銅暴露后,鯉腸道微生物多樣性和物種豐富度無顯著差異(P0.05)。在門一級水平上,所有序列共被注釋到了58個門,主要包括是:變形菌門(Proteobacteria,51.73%),梭桿菌門(Fusobacteria,10.97%),擬桿菌門(Bacteroidetes,5.24%),厚壁菌門(Firmicutes,4.76%),藍藻菌門(Cyanobacteria,4.24%),放線菌門(Actinobacteria,3.02%),疣微菌門(Verrucomicrobia,2.25%),酸桿菌門(Acidobacteria,2.69%),TM6(2.16%),芽單孢菌門(Gemmatimonadete,1.11%),還有一些其它的微生物類群(8.47%)。根據(jù)其在各樣品所占比例變化可以看出,在門水平上,與脂代謝相關(guān)的微生物出現(xiàn)顯著變化,即與對照組相比,低濃度組梭桿菌門(Fusobacteria)的比例顯著升高(P0.05);高濃度組厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的比例顯著降低(P0.05)。
【學(xué)位單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 3-1 實時熒光定量檢測鯉肝胰臟脂代謝相關(guān)基因的表達量圖中數(shù)據(jù)以 mean ± SE 表示（n=3），不同字母表示差異顯著（P<0.05）。Fig. 3-1 qRT-PCR analysis of gene expression of lipid metabolism-related genes in liverError bars indicate the mean and standard error (n=3). Different letters indicate statistical difference(P<0.05).

圖 3-2 實時熒光定量檢測鯉腸道緊密結(jié)合蛋白基因的表達量圖中數(shù)據(jù)以 mean ± SE 表示（n=3），不同字母表示差異顯著（P<0.05）。Fig. 3-2 qRT-PCR analysis of gene expression of tight binding protein genes in intestineError bars indicate the mean and standard error (n=3). Different letters indicate statistical difference(P<0.05).

圖 4-1 Illumina HiseqTM2500 測序流程圖Fig. 4-1 Flow chart of Illumina HiseqTM2500 sequencing（1）DNA 樣品的檢測對 DNA樣品的檢測主要包括以下 3種方法：

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本文編號：2831193