近年來,病毒性和細菌性疾病的頻繁爆發(fā),給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的養(yǎng)殖風險和壓力。水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預防和治療的主要措施是利用各種抗生素,這在疾病治療中起到了積極的作用,但同時也帶來了病原菌耐藥性、水生動物體內(nèi)菌群失調(diào)、抗生素殘留、食品安全以及海洋環(huán)境污染等問題,且這些問題正在變得越來越嚴重,不僅嚴重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展,而且也導致了巨大的環(huán)境安全風險。當人們認識到使用抗生素等藥物的負面影響后,人們開始尋找天然無毒、無殘留、無污染的安全高效的疾病預防措施。益生菌是一類繁殖速度極快,對環(huán)境適應(yīng)能力極強,對有機質(zhì)等污染物分解極快,種類繁多,分布極廣的微生物,在養(yǎng)殖業(yè)得到了廣泛使用。本研究采用酶活測定和溶血活性檢驗從來源于對蝦養(yǎng)殖水環(huán)境的12株芽孢桿菌中,篩選出4株分泌胞外酶且沒有潛在毒性的芽孢桿菌。4株芽孢桿菌通過耐受膽鹽、耐人工胃液、耐人工腸液、抑菌活性、表面疏水性和自凝聚力等試驗,從中篩選出2株芽孢桿菌,然后將其通過拌料投喂的方式應(yīng)用于凡納濱對蝦仔蝦階段養(yǎng)殖,比較研究了所選芽孢桿菌對凡納濱對蝦各項生理指標以及水質(zhì)的影響,實驗結(jié)果如下:通過測定12株芽孢桿菌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶胞外酶活分泌能力,以及利用山羊血平板法檢測12株芽孢桿菌的潛在致病性,發(fā)現(xiàn)12株芽孢桿菌都具有分泌胞外酶的能力,其中,HNLS-1和HNLD-1分別具有最高的蛋白酶和脂肪酶分泌能力,HNLS-1、HNLD-1和HNSY-1具有較高的分泌淀粉酶能力;溶血試驗結(jié)果顯示HNLS-1、HNLD-1、HNLD-2和HNSY-1,共4株芽孢桿菌在山羊血平板上呈γ溶血,其他8株芽孢桿菌都呈β溶血。綜合高效分泌胞外酶能力和溶血活性兩方面實驗結(jié)果,初步選定芽孢桿菌HNLS-1、HNLD-1、HNLD-2和HNSY-1為凡納濱對蝦養(yǎng)殖的潛在益生菌的備選菌株。利用耐受膽鹽、耐人工胃液、耐人工腸液、抑菌活性、表面疏水性和自凝聚力等實驗方法,對篩選出的HNLS-1、HNLD-1、HNLD-2和HNSY-1進行了體外益生效果研究。結(jié)果顯示菌株HNLS-1、HNLD-1、HHNLD-2在0.6%的高濃度膽鹽條件下活菌數(shù)都較高,而HNSY-1在0.15%低濃度的膽鹽條件下不能生長;菌株HNLS-1、HNLD-1、HNSY-1在人工模擬胃液中培養(yǎng)180min后活菌數(shù)基本不受影響,HNLD-2培養(yǎng)60min后活菌數(shù)降低1 log值;在人工腸液中培養(yǎng)180min后,4株菌的活菌數(shù)基本不變;在與病原菌的拮抗試驗中HNLS-1、HNLD-1、HNSY-1分別對部分弧菌具有拮抗效果,HNLD-1和HNSY-1分別對副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌拮抗效果最明顯,抑菌圈分別為14.53mm和11.43mm, HNLD-2對病原菌沒有拮抗效果;在對二甲苯的疏水活性試驗中HNLD-1和HNLS-1對二甲苯的疏水活性顯著高于HNLD-2和HNSY-1,分別達到73.2%和64%; 4株芽孢桿菌在5h內(nèi),自凝聚率都隨培養(yǎng)時間逐漸升高,但HNLD-1和HNLS-1 3h后的自凝聚力明顯高于HNSY-1和HNLD-2, 5h分別達到最高凝聚率52%和58.5%。綜上結(jié)果表明,在4株芽孢桿菌中,HNLS-1和HNLD-1具備更好的體外益生菌特性,可進一步研究其在水產(chǎn)動物營養(yǎng)和日糧中的應(yīng)用效果。HNLS-1和HNLD-1經(jīng)革蘭氏染色、細菌生理生化鑒定法和16S rDNA序列比對顯示,分別鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus) 。采用拌料投喂的方式,對益生菌株HNLS-1和HNLD-1對凡納濱對蝦仔蝦生長、免疫、抗病力和水質(zhì)的影響進行了研究,結(jié)果顯示:將益生菌HNLS-1和HNLD-1單獨和混合的方式拌入飼料,菌濃度為2.0×109CFU/g的飼料對凡納濱對蝦仔蝦飼喂20d,添加益生菌的處理組,其仔蝦存活率和特定生長率均顯著提高(P0.05),水中氨氮、COD含量以及弧菌總量均顯著低于對照組(P0.05),在淡水、40‰海水和300mg/L亞硝酸鹽極端環(huán)境脅迫下,抗逆性均強于對照組,在濃度為107CFU/mL的哈維氏弧菌強毒株環(huán)境下攻毒1周后,存活率均顯著高于對照組(P0.05);添加益生菌的處理組與對照組相比,均可顯著提高凡納濱對蝦組織中的蛋白酶、脂肪酶、堿性磷酸酶和溶菌酶活力(P0.05),HNLS-1和HNLD-1處理組亦顯著提高了其過氧化物酶活力(P0.05)。由上可見,HNLS-1和HNLD-1能夠促進凡納濱對蝦的健康生長并提高其抗病能力、改善其生長水環(huán)境,因而可作為益生菌應(yīng)用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖中。綜上所述,HNLS-1和HNLD-1可以有效地促進凡納濱對蝦仔蝦的健康生長、增強抗病力,改良水質(zhì),為篩選更多凡納濱對蝦專用益生菌提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S968.22
【部分圖文】：

４．７表面疏水活性逡逑ＨＮＬＤ－１和ＨＮＬＳ－１對二甲苯的疏水活性顯著高于ＨＮＬＤ－２和ＨＮＳＹ－１，分別達到逡逑７３．２％和６４％，邋ＨＮＬＤ－２和ＨＮＳＹ－１對二甲苯的疏水活性沒有顯著性差異（圖１）。逡逑ｉｌｉｉｌ逡逑ＨＮＬＤ－１邋ＨＮＬＳ－１邋ＨＮＬＤ－２邋ＨＮＳＹ－１逡逑圖１邋４株菌對二甲苯的表面疏水性逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋４邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｆｏｒ邋ｘｙｌｅｎｅ逡逑４．８自凝聚力逡逑在化內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間增加，每株菌的自凝聚率都逐漸升高，但ＨＮＬＤ－１和逡逑ＨＮＬＳ－１３ｈ后的自凝聚為明顯高于ＨＮＳＹ－１和ＨＮＬＤ－２，化凝聚率達到５２％和５８．５％；．逡逑ＨＮＬＤ－２自凝聚效果最差，化后凝聚率才２５．８％邋（圖２）。邐＾逡逑７０邋１逡逑８邋５０邋—邐－＾ＨＮＬＤ－１逡逑ｆ邋２０邋－香掃ＮＳＹ－１逡逑ＩＱ邋＿邐－＾ＨＮＬＤ－２逡逑０邋＾邐ｉ邐Ｉ邐ｉ邐ｉ邐Ｉ逡逑１邐２邐３邐４邐５逡逑ｒｉｍｅ邋（ｈ）逡逑國２４株菌的自凝聚力逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋Ａｕｔｏａｇｇｒｅｇａｔｉｏ

１４４６ｂｐ的基因片段，將這２株菌株的基因序列與Ｇｅｎｂａｎｋ中同源性最高的及親緣關(guān)系逡逑較遠的共２４株其他菌株的基因序列進行同源性比對和多序列匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)進化逡逑樹（圖３），結(jié)果表明：ＨＮＬＳ－１與３株地衣芽抱桿菌聚為一支，ＨＮＬＤ－１與２株彎曲芽抱逡逑桿菌聚為一支，置信度達９９％，同親緣關(guān)系較遠的枯草芽袍桿菌（化化）、環(huán)逡逑狀芽拖桿菌（ＳａｃＷｗｃｉｒｃｗ／ｏＭＳ）、凝結(jié)芽抱桿菌短小芽抱桿菌逡逑（公口礎(chǔ)山／＞？７？？化５）等分支明顯。結(jié)合生化鑒定和表型特征，可＾判定吐化８－１為地衣逡逑芽抱桿菌。ＨＮＬＤ－１為彎曲芽抱桿菌。逡逑１６逡逑

分別為１．９４ｍｇ／Ｌ，邋１．９５ｍｇ／Ｌ，２．１９ｍｇ／Ｌ，顯著低于對照組的３．７３ｍｇ／Ｌ。９天后，逡逑每個組ＮＨ３－Ｎ濃度都開始下降，但對照組ＮＨ３－Ｎ含量總體高于添加芽抱桿菌的Ｈ個紐。逡逑（圖１）逡逑４．５邋］逡逑４邋－邐Ｔ逡逑穿邋２．５邋尸－－？－ＨＮＬＤ－１逡逑x錚保幻詞簦簨逡逑１邋－邐ｗＯｗ邋魯對瀩逡逑０，５邋－邐Ｉ邋＊邐？逡逑０邋■＊邐！邋Ｉ邋ｉ邋！邋ｆ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋Ｉ逡逑０邐１邐３邐５邐７邐９邋１１邋１３邋１５邋１７邋１９逡逑養(yǎng)殖天數(shù)逡逑圖１水中ＮＨｉ－Ｎｔ變化逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎ化ａｔｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ＮＨｓ－Ｎｔ邋ｉｎ邋ｗａｔｅｒ逡逑３N２亞硝酸鹽逡逑對各組Ｎ０２－Ｎ濃度平均值進行單因素方差分析，結(jié)果顯示，實驗組與對照組水體逡逑中Ｎ０２－Ｎ含量都沒有顯著性差異。＞０．０５）。養(yǎng)殖０－７天內(nèi)，各組Ｎ０２－Ｎ含量都緩慢X楀義銑�，各讬┊紲Z模危茫瑁魏棵揮邢災(zāi)鉅�。Ｕu旌�，｝x危蹋櫻保齲危蹋模弊橛攵哉兆殄義希危埃玻魏靠佳桿偕擼齲危蹋櫻弊楹停齲危蹋模弊樵冢固旌蟛趴佳桿賆椉�。各组辶x顯詰冢保程歟危埃玻聞ǘ卻锏劍埃叮恚紓蹋咨喜⑶饔諼榷ā＃ㄍ跡玻╁義希玻插義

本文編號：2831041