異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一。由鯉皰疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染引起的鯽造血器官壞死癥是一種嚴(yán)重的病毒性傳染病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,開展鯽魚抗病毒防御機(jī)制研究對其病毒性疾病的防控具有重要的現(xiàn)實意義。干擾素(Interferon,IFN)是一類重要的分泌型細(xì)胞因子,能夠抑制病毒增殖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,在先天性和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要作用。目前,I型干擾素(IFN-I)已在多種硬骨魚類中得到研究,但有關(guān)異育銀鯽IFN-I的研究還未深入開展。本研究克隆獲得一種異育銀鯽IFN-I基因(CagIFNa),完成了對該基因的鑒定和序列結(jié)構(gòu)分析,分析了CagIFNa在體內(nèi)和體外的表達(dá)模式,并對CagIFNa在鯽魚腦細(xì)胞系(Gibel carp brain cell line,GiCB)中抵抗CyHV-2感染的抗病毒活性進(jìn)行了研究。旨在進(jìn)一步揭示魚類先天性抗病毒感染機(jī)制,為鯽魚皰疹病毒造血器官壞死癥的有效防控奠定理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.CagIFNa的克隆和序列結(jié)構(gòu)分析基于RACE PCR技術(shù),以異育銀鯽腎臟組織總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,得到CagIFNa基因cDNA序列全長為724 bp,預(yù)測ORF長度為552 bp,可編碼183個氨基酸。CagIFNa序列中存在兩個保守的半胱氨酸殘基(C1:C~(24),C2:C~(120)),N端含有一個長度為23個氨基酸的信號肽。氨基酸序列相似性分析表明,CagIFNa與鯉科魚類IFN的相似性最高。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,CagIFNa與硬骨魚類I類IFN-I家族的IFNa亞型基因聚為一支。2.CagIFNa體內(nèi)表達(dá)特征熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:CagIFNa在健康異育銀鯽被檢測的9種組織中均有表達(dá),并且肝臟、腸、脾臟和頭腎中的表達(dá)水平相對較高。異育銀鯽感染CyHV-2后,頭腎中CagIFNa的表達(dá)量在12 h、24 h和48 h與對照組相比顯著下調(diào),然而120 h的表達(dá)量顯著上調(diào)至對照組的6倍;脾臟中CagIFNa的表達(dá)量在感染后24 h、48 h和120 h與相應(yīng)對照組相比均顯著下降。3.Poly I:C刺激和CyHV-2感染條件下CagIFNa體外時序表達(dá)模式熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:poly I:C刺激GiCB細(xì)胞后,細(xì)胞中CagIFNa的表達(dá)量從6 h開始顯著升高,12 h達(dá)到峰值,為相應(yīng)對照組的347倍,隨后表達(dá)量下降但仍高于對照組;CyHV-2感染后,細(xì)胞中CagIFNa的表達(dá)量在6 h顯著上調(diào),隨后表達(dá)量逐漸下降,但在120 h表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)到峰值,為對照組的10.7倍。4.CagIFNa的抗病毒活性研究構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-CagIFNa并轉(zhuǎn)染GiCB細(xì)胞,western-blot檢測結(jié)果顯示:CagIFNa蛋白能夠在GiCB細(xì)胞中實現(xiàn)過表達(dá)并分泌到細(xì)胞外。pCMV-HA-CagIFNa轉(zhuǎn)染GiCB細(xì)胞,研究CagIFNa在細(xì)胞水平上的抗病毒能力,結(jié)果顯示:CagIFNa能夠顯著減弱由CyHV-2感染引起的細(xì)胞病變效應(yīng),并且使病毒滴度在感染后24 h、48 h和120 h分別比相應(yīng)對照組下調(diào)6.8倍、18.6倍和69.2倍;同時,熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)CagIFNa的細(xì)胞在感染CyHV-2后,病毒基因CTP、MCP和TK的表達(dá)量與對照組相比均顯著降低。CagIFNa表現(xiàn)出顯著的抑制病毒復(fù)制的能力。5.CagIFNa激活I(lǐng)FN-I系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的研究熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)CagIFNa的GiCB細(xì)胞在感染CyHV-2后,細(xì)胞中IFN-I系統(tǒng)相關(guān)基因包括IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、Mx1和PKR的表達(dá)量相較于對照組均顯著上調(diào)。CagIFNa可以有效誘導(dǎo)IFN-I系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)宿主抗病毒免疫應(yīng)答的激活。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

圖 1.1 硬骨魚類 I 型干擾素抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 (Zhu et al 2013)Fig. 1.1 Diagram of the anti-virus signaling of type I IFNs in teleost fish (Zhu et al 2013) 硬骨魚類 I 型干擾素抗病毒功能及其應(yīng)用IFN-I 的功能在哺乳動物中已經(jīng)得到了較為充分的研究，其中 IFN-I 功能主要包括：抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖與抗腫瘤以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等前針對硬骨魚類 IFN-I 的研究主要是鑒定了其抗病毒功能，也有少量研究報 IFN-I 的免疫調(diào)節(jié)功能，而針對魚類 IFN-I 其它功能的研究卻鮮有報道。1 I 型干擾素抗病毒功能在哺乳動物中實際上只有 IFN-I 和 IFN-III 真正發(fā)揮先天性抗病毒作用，將它

2.2 臨床癥狀及病理特征異育銀鯽患皰疹病毒造血器官壞死癥后臨床癥狀表現(xiàn)為：呼吸急促、嗜睡、食欲不振、離群獨游 (羅丹 2014；田飛焱等 2012)。如圖 1.2 所示，病魚眼球突出，鰓部嚴(yán)重壞死，鰓絲腫脹并且有充血或出血的現(xiàn)象，鰓小片糜爛融合，病魚體表和鰭條基部有出血點，肛門紅腫，腹部腫大甚至有些病魚直腸從腹部漏出；解剖病魚后，可以看到脾臟和腎臟有不同程度的腫脹和出血，鰾的表面有點出血(Jeffery et al 2007; Whittington and Chong 2007; 林秀秀等 2016)。組織學(xué)檢查顯示患鯉造血器官壞死癥的鯽魚腎臟、脾臟、肝臟和鰓組織有系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)，包括血細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核肥大，染色質(zhì)邊集化，組織上皮細(xì)胞脫落、空泡變性和局灶性壞死 (Ding et al 2014)。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文CagIFNa 基因 cDNA 序列全長為 724 bp (Genbank 登錄號：MK093763)，序列中包含長度為57 bp的 5' UTR，115 bp 的 3' UTR和 552 bp 的開放閱讀框 (ORF,open reading frame)，使用 ExPASy 預(yù)測 CagIFNa ORF 可編碼長度為 183 個氨基酸 (aa, amino acid) 的多肽鏈 (圖 2.1)。預(yù)測 CagIFNa 蛋白質(zhì)分子量為 21.943kDa，理論等電點為 9.23。使用 SignalP 程序分析 CagIFNa 氨基酸序列，其 N 端前 23 個氨基酸被鑒定為信號肽序列。

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本文編號：2831017