文昌魚屬于頭索動(dòng)物,在無脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物的進(jìn)程中占據(jù)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置,是研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的珍貴模式生物。先前的眾多研究表明,在文昌魚中存在類似于脊椎動(dòng)物肝臟的組織被稱為肝盲囊。肝臟是脊椎動(dòng)物特有器官,是維持糖代謝平衡的重要場(chǎng)所。那么文昌魚肝盲囊是否也具有類似的調(diào)節(jié)糖代謝功能呢?這是本文研究的主要問題。脊椎動(dòng)物的葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)由三種同工酶組成,即G6Pase-Ⅰ、 G6Pase-Ⅱ和G6Pase-Ⅲ。它能催化葡萄糖-6-磷酸水解成為磷酸基和游離的葡萄糖,這個(gè)催化過程是糖異生和糖原分解的最后一個(gè)關(guān)鍵步驟,因此對(duì)血糖水平的調(diào)節(jié)具有十分重要的作用。目前有大量的研究針對(duì)的是脊椎動(dòng)物中的葡萄糖-6-磷酸酶,但在無脊椎動(dòng)物當(dāng)中有關(guān)葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)和調(diào)控的研究則十分有限。本文對(duì)文昌魚(Branchiostoma japonicum)中的葡萄糖-6-磷酸酶進(jìn)行了鑒定,獲得了全長(zhǎng)為2053 bp的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列,其中開放閱讀框?yàn)?095 bp,編碼364個(gè)氨基酸。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)此預(yù)測(cè)的蛋白序列與脊椎動(dòng)物的三種G6Pase具有29.8%至39.1%的一致性,與無脊椎動(dòng)物有20.4%至46.7%的一致性。雖然斑馬魚的G6Pase與文昌魚的序列一致性只有33.6%和38.8%,但是它們的3D結(jié)構(gòu)具有驚人的相似性,暗示文昌魚G6Pase與斑馬魚G6Pase的功能也具有一定的相似性。有關(guān)進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)分析和共線性等分析結(jié)果顯示了文昌魚G6Pase與脊椎動(dòng)物的G6Pase-Ⅲ具有更密切的關(guān)系。因此,文昌魚的G6Pase可能與脊椎動(dòng)物G6Pase-Ⅲ類似,是G6Pase基因原型代表,而脊椎動(dòng)物的三種G6Pase是在進(jìn)化過程中經(jīng)過兩輪基因復(fù)制產(chǎn)生的。我們通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)檢測(cè)到G6Pase在肝盲囊和卵巢中大量表達(dá),具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)。我們也證明了文昌魚肝盲囊和斑馬魚肝臟在經(jīng)過重組斑馬魚生長(zhǎng)激素(rzGH)處理之后G6Pase的表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。然后,利用rzGH進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間處理,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,rzGU仍舊具有促進(jìn)作用�？偠灾�,rzGH所引起的G6Pase的表達(dá)模式和趨勢(shì)在文昌魚肝盲囊和斑馬魚肝臟中是相似的。通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)文昌魚肝盲囊提取物和鼠肝臟提取物都能與鼠抗人的G6Pase抗體發(fā)生結(jié)合,在大約40kDa的位置形成一條與我們所預(yù)測(cè)的蛋白大小近似的條帶,這證明了在文昌魚中存在天然的葡萄糖-6-磷酸酶。然后,我們通過測(cè)定肝盲囊,腸和去除兩者后的文昌魚提取物中的G6Pase活性,來定位該酶主要的表達(dá)部位。結(jié)果顯示肝盲囊中G6Pase的活性要比腸高出1.6倍,而在去除肝盲囊和腸的文昌魚提取物中其活性極其低。隨后,我們對(duì)文昌魚進(jìn)行了饑餓和投喂處理,然后剖取肝盲囊進(jìn)行G6Pase活性測(cè)定,與對(duì)照相比,G6Pase的活性在饑餓狀態(tài)下提高了82%,并且在攝食之后降低到原先活性的75%,而文昌魚肝盲囊中G6Pase活性的這種變化(在投喂之后降低,饑餓處理之后升高)與脊椎動(dòng)物中觀測(cè)到的結(jié)果一致�？偠灾�,本文論述了文昌魚葡萄糖-6-磷酸酶在結(jié)構(gòu)和功能方面都與脊椎動(dòng)物相似。此外,文昌魚和斑馬魚在生長(zhǎng)激素的刺激下G6Pase基因表現(xiàn)出了相似的表達(dá)模式和趨勢(shì),表明G6Pase的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)在文昌魚中已經(jīng)發(fā)生了一定的進(jìn)化。這些結(jié)果都為文昌魚肝盲囊與脊椎動(dòng)物肝臟同源性并且在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用這一推論提供了有力證據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4

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本文編號(hào)：2826564