當前,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了諸多的病害問題,其中以水產(chǎn)致病細菌引發(fā)的病害問題尤為嚴重,其爆發(fā)性強、來勢迅猛。如何能有效防治水產(chǎn)病害是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要任務。傳統(tǒng)上,防治水產(chǎn)細菌性病害的重要手段是化學抗生素或化學藥物,化學抗生素或化學藥物確實在一定程度上解決了細菌性病害問題,但使用化學抗生素或化學藥物往往會帶來病原菌耐藥性、水產(chǎn)品藥物殘留和環(huán)境污染等問題,因此,尋找無污染、無耐藥性和無公害的化學抗生素或化學藥物替代物成為解決問題的關鍵。深海芽孢桿菌代謝途徑多樣性及頑強的生命力,賦予了其具有分泌新型抑菌活性物質的能力。從深海芽孢桿菌中分離出能拮抗水產(chǎn)致病細菌且無公害、無耐藥性的蛋白,是當前防治水產(chǎn)病害的研究熱點。本論文針對我國突出的水產(chǎn)細菌病害和水產(chǎn)品安全問題,通過對西太平洋雅浦海溝的水樣篩選,獲得對水產(chǎn)病原細菌強拮抗作用的菌株,對菌種發(fā)酵培養(yǎng),通過硫酸銨分級沉淀和葡聚糖凝膠層析法獲得具有抗菌生物活性的蛋白,該蛋白具有較好防治水產(chǎn)病原細菌的能力,可作為化學抗生素或化學藥物替代物解決水產(chǎn)細菌性疾病問題。研究的主要結果如下:1.拮抗水產(chǎn)細菌病害DH82菌株篩選分離及鑒定本論文用加熱處理、梯度稀釋法,結合形態(tài)學觀察從西太平洋雅浦海溝6000米深的水樣中分離出106株芽孢桿菌,對其進行拮抗水產(chǎn)病原細菌的初篩實驗,篩選出79株拮抗菌;然后,再對拮抗菌活性產(chǎn)物是否是蛋白進行復篩,得到具有高抗菌蛋白活性的DH82菌株。DH82菌株鑒定采用形態(tài)學觀察、生理學和生物生化特性研究以及分子生物學分析三者相結合的方法。最后鑒定DH82菌株為貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis。2.貝萊斯芽孢桿菌DH82抗菌粗蛋白制備及理化性質研究為進一步研究抗菌活性物質的性質,用改良LB培養(yǎng)基培養(yǎng)貝萊斯芽孢桿菌DH82,研究貝萊斯芽孢桿菌DH82生長特性,確定其產(chǎn)抗菌蛋白的最佳發(fā)酵時間為24 h。通過硫酸銨分級沉淀法獲取抗菌蛋白,確定最佳硫酸銨沉淀飽和度為70%。研究了抗菌粗蛋白理化性質,以遲緩愛德華氏菌作為指示病原細菌,結果發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌DH82的抗菌粗蛋白熱穩(wěn)定性較強,對蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶都不敏感,在pH7.0抑菌活性最佳,金屬K~+、Na~+促進抗菌粗蛋白活性,金屬Mg~(2+)、Fe~(3+)部分抑制抗菌粗蛋白活性,金屬Ca~(2+)嚴重抑制其抑菌活性。3.抗菌粗蛋白初步分離純化及其抑菌譜檢測通過對貝萊斯芽孢桿菌DH82的抗菌粗蛋白進行Sephadex G-75柱層析分離純化,獲得兩個具有抑菌活性的峰蛋白PrI和PrII。兩個峰蛋白PrI和PrII經(jīng)抑菌譜檢測,發(fā)現(xiàn)對常見水產(chǎn)指示病原細菌包括遲緩愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌都具有較好抑菌活性,說明深海貝萊斯芽孢桿菌DH82產(chǎn)生的抗菌粗蛋白對水產(chǎn)病原細菌的抑菌譜較廣,其中峰蛋白PrII對指示植物病原真菌水賊鐮刀菌也具有較好抑菌作用。再進一步對峰蛋白進行最低抑菌濃度(MIC)檢驗,發(fā)現(xiàn)其對遲緩愛德華氏菌和溶藻弧菌的MIC都較低(為7.16μg/mL)。因此,得出深海貝萊斯芽孢桿菌DH82具有較廣的抑菌譜及較強的抑菌活性,預示該菌株在常見水產(chǎn)細菌性及個別植物真菌性病害防治上有較好的開發(fā)利用價值。
【學位單位】：自然資源部第三海洋研究所
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S941.42
【部分圖文】：

圖 2-1 部分活性菌株的抑菌活性Fig. 2-1 The antimicrobial activity of partial active strainsa 嗜水氣單胞菌 b 遲緩愛德華氏菌 c 坎氏弧菌 d 副溶血弧菌 e 溶藻弧d-2 e-2

DH82菌株的革蘭氏染色Fig.2-2TheGramologicalphotographofstrainDH82

圖 2-3 基于 16S rDNA 序列 BLAST 結果構建菌株 DH82 的系統(tǒng)進化樹Fig. 2-3 Phylogentic tree of strain DH82 based on BLAST results of 16S rDNAsequence

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