本文設(shè)置蛋白質(zhì)水平為30%、36%、42%和48%的4種不同梯度的實(shí)驗(yàn)飼料,運(yùn)用營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)等研究方法,分析了不同蛋白質(zhì)水平對(duì)淀山湖日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)生長(zhǎng)性能、免疫性能以及抗亞硝酸鹽脅迫的影響,同時(shí)克隆了與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的蛻皮調(diào)控基因-幾丁質(zhì)脫乙酰酶1(CDA1)及與免疫相關(guān)的吞噬細(xì)胞蛋白(PAP),分析了二者在不同的營(yíng)養(yǎng)條件下及不同組織的表達(dá)水平差異。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了不同地區(qū)不同地方種群的日本沼蝦在不同的蛋白營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)、免疫性能的差異,并對(duì)不同種群之間的遺傳多樣性上進(jìn)行了分析。本文的主要結(jié)果如下:1.不同蛋白含量飼料對(duì)淀山湖日本沼蝦生長(zhǎng)性能影響飼料中蛋白質(zhì)含量在42%與48%時(shí),日本沼蝦的特定生長(zhǎng)率、增重率、存活率顯著高于其它組(P0.05)。隨著蛋白質(zhì)水平的提高,肝胰腺蛋白酶與淀粉酶活力也呈逐漸上升趨勢(shì),42%與48%蛋白含量組活性最高(P0.05),但兩組之間沒(méi)有明顯差異(P0.05)。脂肪酶與纖維素酶各組差異不顯著(P0.05)。肌肉中粗蛋白含量隨著飼料中蛋白含量的升高而升高,48%組最高(P0.05),與42%組差異不顯著(P0.05),顯著高于30%與36%組(P0.05)。其余水分、粗脂肪,各組無(wú)明顯差異。賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸等必需氨基酸隨著飼料蛋白含量的升高而升高,48%組最高,但與42%組差異不顯著(P0.05)。氨基酸總量與必需氨基酸均隨著飼料蛋白質(zhì)含量的升高而升高。日本沼蝦CDA1基因全長(zhǎng)2435p,包含開(kāi)放閱讀框(ORF)1632bp,編碼535個(gè)氨基酸,5’端和3’端非編碼區(qū)分別為29bp和684bp,3’端以polyA結(jié)尾。該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分析量為60.8kDa,理論等電點(diǎn)為4.58。RT-PCR結(jié)果表明,CDA1在肝胰腺、肌肉、眼柄、鰓和心臟中均有分布,在肝胰腺中表達(dá)量最高。在肝胰腺和鰓的表達(dá)量隨著蛋白含量的增高逐漸升高,在肌肉的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P0.05)。2.飼料中蛋白含量對(duì)淀山湖日本沼蝦抗嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染、免疫性能及抗氧化的影響主要通過(guò)控制飼料中的蛋白質(zhì)含量,探究了日本沼蝦在不同營(yíng)養(yǎng)條件下抗嗜水氣單胞菌、抗氧化、免疫性能以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明:隨著飼料中蛋白含量的提高,日本沼蝦感染嗜水氣單孢菌后的存活率逐漸上升,48%組最高,超氧化物岐化酶(SOD)與過(guò)氧化氫酶(CAT)活性也逐漸升高,但谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)各組差異不顯著(P0.05),堿性磷酸酶(AKP)與溶菌酶(LSZ)隨著飼料蛋白含量的升高而升高,48%組活性最高。PAP全基因序列包含開(kāi)放閱讀框(ORF)363bp,編碼120個(gè)氨基酸,5’端和3’端非編碼區(qū)分別為96bp和363bp,3’端以polyA結(jié)尾,蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分析量為13.5kDa。RT-PCR結(jié)果表明,PAP在肝胰腺、肌肉、眼柄、鰓和心臟中均有分布,在肝胰腺中表達(dá)量最高,在肝胰腺和鰓的表達(dá)量隨著蛋白含量的增高逐漸升高,在肝胰腺的表達(dá)量在96h內(nèi)先升高后下降,24h后表達(dá)量趨于穩(wěn)定,48h到96h后表達(dá)量基本不變。3.飼料中不同蛋白含量對(duì)淀山湖日本沼蝦抗亞硝酸鹽脅迫的研究以半數(shù)致死濃度13.3mg/L亞硝酸鈉(Na_2NO_2)脅迫,研究飼料中不同蛋白質(zhì)水平對(duì)日本沼蝦抗亞硝酸鹽脅迫的影響。結(jié)果表明:攻毒結(jié)束后隨著飼料中蛋白含量的提高,日本沼蝦鈉鉀ATP酶(Na~+K~+ATPase)和鈣鎂ATP(Ca~(2+)Mg~(2+)ATPase)活性逐漸升高,肝胰腺和鰓酸性磷酸酶(ACP)與堿性磷酸酶(AKP)的活性逐漸升高,組間差異顯著(P0.05),但都低于對(duì)照組,肌肉中差異不顯著(P0.05)。利用組織切片與透射電鏡觀察不同含量蛋白質(zhì)飼喂后的日本沼蝦肝胰腺在亞硝酸鹽脅迫下的變化,發(fā)現(xiàn)在30%蛋白營(yíng)養(yǎng)組的肝胰腺與對(duì)照組差異明顯,電鏡下顯示細(xì)胞內(nèi)損傷嚴(yán)重,隨著蛋白含量的升高,與對(duì)照組差異減小,損傷有所減緩。4.飼料中不同蛋白含量對(duì)洞庭湖(DT)、淀山湖(DS)及洞庭湖(♂)和淀山湖(♀)雜交子一代日本沼蝦生長(zhǎng)及免疫性能影響,及生長(zhǎng)與遺傳多樣性關(guān)系分析為了研究日本沼蝦淀山湖(DS)群體、洞庭湖(DT)群體以及以DS為父本,DT為母本繁育子一代(DTDS)群體,在不同營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)與免疫性能的差異,以及生長(zhǎng)性能與遺傳多樣性的之間的關(guān)系,設(shè)置蛋白質(zhì)水平為30%、36%、42%的3種不同梯度的實(shí)驗(yàn)飼料,飼喂8周后測(cè)定生長(zhǎng)與免疫性能,并利用11對(duì)高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)計(jì)算并統(tǒng)計(jì)了平均觀測(cè)等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、遺傳雜合度、Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)、遺傳相似系數(shù)等數(shù)據(jù)。結(jié)果表明3個(gè)群體中DTDS的增重率和特定生長(zhǎng)率在各個(gè)營(yíng)養(yǎng)條件下均高于DS、DT,飼料系數(shù)DTDS低于DS、DT,存活率各組差異不顯著。蛋白酶和淀粉酶在42%水平下DTDS顯著高于其余其DS、DT(P0.05),在30%與36%各組差異不顯著(P0.05),堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶,等隨著飼料中蛋白含量的升高而升高,DTDS的在三個(gè)梯度下均高于DS、DT。微衛(wèi)星分析結(jié)果3個(gè)日本沼蝦群體均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平,其中平均期望雜合度均大于0.733,顯示出較高的遺傳多樣性水平。Fst值介于0.00954~0.3171,屬于中等偏下分化。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了Mn10、Mn12、Mn33、Mn39與體重體長(zhǎng)相關(guān),其中Mn10位點(diǎn)的aa基因型與體重體長(zhǎng)負(fù)相關(guān),bb基因型與體重正相關(guān),Mn12的aa基因型與體重負(fù)相關(guān),ab基因型與體長(zhǎng)負(fù)相關(guān),Mn33位點(diǎn)的ee基因型與體重負(fù)相關(guān),Mn39位點(diǎn)的bb基因型與體重體長(zhǎng)負(fù)相關(guān),據(jù)此推斷與日本沼蝦生長(zhǎng)相關(guān)的的調(diào)控基因可能定位于這幾個(gè)位點(diǎn)附近。不同種群標(biāo)記雜合度與生長(zhǎng)性能存在一定的線性關(guān)系,但是在不同營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)性能趨勢(shì)與雜合度之間線性關(guān)系不顯著。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S968.22
【部分圖文】：

圖 2-1 飼料蛋白質(zhì)水平對(duì)日本沼蝦終末體重的影響Fig. 2-1 Effect of different levels of protein content on the final weight of M. nipponense注：不同字母代表差異顯著（P<0.05）Note：different letters are significantiy different（P<0.05）2.1.2.2 飼料中不同蛋白質(zhì)水平對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響表 2-2 各組日本沼蝦的生長(zhǎng)性能Tab. 2-2 Growth performance of M.nipponense in different groups飼料組 增重率（%） 存活率（%） 特定生長(zhǎng)率（%） 飼料系數(shù)30% 84.28±2.81a57%±2.31a0.65±0.01a2.29±0.23a36% 89.81±2.79b59%±2.41a0.71±0.03b1.875±0.67b42% 96.49±2.78c65%±1.34b0.89±0.02c1.47±0.089c48% 98.67±2.79c64%±1.32b0.86±0.01c1.55±0.019c注：不同字母代表差異顯著（P<0.05）

圖 2-3 CDA1 編碼蛋白的成熟肽氨基酸組成分析Fig. 2-3 Analysis on the amaino composition of mature peptide from MnCDA1根據(jù) MnCDA1 編碼蛋白的 cDNA 序列推導(dǎo)的氨基酸序列組成見(jiàn)圖 2-2，其中色氨酸（Trp）比例最高（8.5%），其次為天冬氨酸（Asp）7.3%、谷氨酸（Glu7.1%、天冬酰胺（Asn）6.9%。2.4.2.2 MnCDA1 編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析日本沼蝦MnCDA1編碼的蛋白包含一個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰催化結(jié)構(gòu)域（194-469兩個(gè)低密度脂蛋白受體 A 類(lèi)結(jié)構(gòu)域（119-153，119-150）。從圖 2.4 MnCDA1 編碼的二級(jí)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，α螺旋 A 區(qū)明顯少于β螺旋 B 區(qū)，此外，利用同源基因比對(duì)網(wǎng)站建立的 MnCDA1 編碼蛋白的三圍結(jié)構(gòu)模式圖，也證明β螺旋在二級(jí)結(jié)構(gòu)中占據(jù)大范圍空間。

MnCDA1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)位置示意圖

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本文編號(hào)：2825631