中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種之一,具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和科研價值。然而,細(xì)菌性疾病的頻發(fā)為中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以中華絨螯蟹為研究對象,利用免疫熒光、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、免疫印跡實驗(Western blot)和雙鏈RNA干擾(Double strands RNA interference,dsRNAi)等生物學(xué)技術(shù)分析了Beclin(命名為EsBeclin-1)、腺苷酸激活蛋白激酶β亞基(AMP-activated protein kinaseβsubunit,AMPKβ,命名為Es AMPKβ)和Akirin(命名為EsAkirin)的分子特征及其參與調(diào)控抗菌肽表達(dá)的功能。EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的開放閱讀框分別為1 275 bp、888 bp和615 bp,各編碼424、295和204個氨基酸。EsBeclin-1具有典型的APG6結(jié)構(gòu)域及CCD和ECD結(jié)構(gòu)域;EsAMPKβ具有典型的AMPKβ和CBM結(jié)構(gòu)域;EsAkirin沒有明確的結(jié)構(gòu)域,但具有較保守的氨基端和羧基端結(jié)構(gòu)及兩個保守的核定位序列。EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin均呈組成型表達(dá)。免疫熒光分析結(jié)果表明,EsBeclin-1和EsAMPKβ蛋白主要分布在血淋巴細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中,EsAkirin主要分布在細(xì)胞核中。利用qRT-PCR檢測了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激后中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明LPS和A.hydrophila刺激后,EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的mRNA表達(dá)水平顯著升高,分別在刺激后6 h(為對照組的4.70±0.70倍和2.91±0.46倍,p0.01)、12 h(為對照組的3.19±0.58倍和2.69±0.30倍,p0.01)和24 h(為對照組的5.04±1.01倍和3.10±0.84倍,p0.01)達(dá)到最高表達(dá)水平。此外,LPS刺激2 h后,血淋巴細(xì)胞中的EsBeclin-1蛋白出現(xiàn)聚集,呈斑點(diǎn)狀分布。為研究EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin對抗菌肽表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,本研究利用dsRNA抑制EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的表達(dá)(dsRNA注射24 h后干擾效率均達(dá)60%以上),并在此基礎(chǔ)上對血淋巴細(xì)胞中抗菌肽的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,LPS刺激EsBeclin-1干擾的中華絨螯蟹6 h后,EsALF2(0.55±0.08倍,p0.05)、EsLYZ(0.21±0.04倍,p0.01)、EsCrus(0.49±0.08倍,p0.01)和EsCrus2(0.46±0.11倍,p0.01)的表達(dá)水平顯著低于對照組;EsAMPKβ干擾后,EsALF2(0.44±0.10倍,p0.01)和EsLYZ(0.69±0.20倍,p0.05)的表達(dá)水平受到抑制;LPS刺激EsAkirin干擾的中華絨螯蟹12 h后,EsALF2(0.26±0.07倍,p0.01)、EsLYZ(0.54±0.10倍,p0.01)、EsCrus2(0.54±0.17倍,p0.01)和EsDWD1(0.56±0.1倍,p0.05)的表達(dá)量顯著降低。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),EsAkirin能顯著增強(qiáng)NF-κB啟動子表達(dá)質(zhì)粒的熒光素酶活性(2.72±0.40倍,p0.01)。綜上所述,EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的分子結(jié)構(gòu)均較為保守,具有典型的結(jié)構(gòu)特征;EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin都參與LPS和A.hydrophila刺激引起的免疫應(yīng)答;EsBeclin-1和EsAMPKβ分布在中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中,EsAkirin分布在細(xì)胞核中;EsBeclin-1能影響EsALF2、EsLYZ、EsCrus和EsCrus2的轉(zhuǎn)錄,EsAMPKβ參與EsALF2和EsLYZ的調(diào)節(jié),EsAkirin在EsALF2、EsLYZ、EsCrus2和EsDWD1的調(diào)節(jié)過程中具有重要作用;EsAkirin能通過增強(qiáng)NF-κB的活性。以上結(jié)果表明EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin之間可能通過同一途徑共同調(diào)節(jié)EsALF2和EsLYZ的轉(zhuǎn)錄,參與中華絨螯蟹抗細(xì)菌免疫。本研究不僅為進(jìn)一步探索甲殼動物抗細(xì)菌免疫防御機(jī)制提供了理論依據(jù),而且為無脊椎動物免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供了參考。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

1 前言 無脊椎動物免疫脊椎動物的免疫系統(tǒng)分為固有免疫和適應(yīng)性免疫，在復(fù)雜的環(huán)境中具有更加完備機(jī)制。然而，無脊椎動物不具有類似脊椎動物的適應(yīng)性免疫，在充滿各種刺激的，無脊椎動物依賴固有免疫阻止病原入侵。無脊椎動物免疫系統(tǒng)主要由細(xì)胞免疫免疫構(gòu)成，其中細(xì)胞免疫主要包括吞噬、黑化和包囊及細(xì)胞粘連作用等，體液免包括抗菌肽合成、酚氧化還原酶釋放、凝集素以及補(bǔ)體分子等（見圖 1-1）[1]。

圖 1-2 Toll 和 IMD 通路調(diào)節(jié) AMPs 基因的表達(dá)ig 1-2 The Toll and IMD signaling pathways in regulating the expression of antimicrobial peptiBeclin-1、AMPK 和 Akirin 參與調(diào)節(jié) Toll 和 IMD 通路現(xiàn)已知 Toll 和 IMD 通路在無脊椎動物的固有免疫中發(fā)揮著重要作用，并且，物 Toll 通路與哺乳動物 IL-1/TLR 通路非常相似（見圖 1-3），他們具有相似的 同 的 信 號 傳 遞 分 子 （ 如 Myd88 、 腫 瘤 壞 死 因 子 相 關(guān) 受mor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6）和 Cactus），IMD 通路與 TNF-R 途徑相似[37]。研究表明，脊椎動物和無脊椎動物的 Beclin-1、AMPK 和些通路中都發(fā)揮著一定的作用，下面主要簡述 Beclin-1、AMPK 和 Akirin 的分其參與的一些過程。

圖 1-3 TLR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fig 1-3 TLR signaling pathway Beclin-1 的特征及其參與免疫調(diào)節(jié)的研究998 年，Liang 等在大鼠的致死性辛德畢斯病毒性腦炎（Fatal sindbhalitis）研究中發(fā)現(xiàn)了與 Bcl-2 發(fā)生相互作用的蛋白 Beclin[38]。隨后，在人s）、果蠅（D. melanogaster）及線蟲（Caenorhabditis elegans）等物種中也eclin。哺乳動物有兩個 Beclin，分別命名為 Beclin-1 和 Beclin-2，其他脊椎動物中只存在 1 個 Beclin 基因，命名為 Beclin-1 或 Atg6[39]。Beclin 蛋白具結(jié)構(gòu)域：BH3 結(jié)構(gòu)域（Bcl-2 homolog 3 (BH3) domain）、中央卷曲螺旋tral coiled-coil domain, CCD）和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域（Evolutionarily conserved （見圖 1-4A）。ECD 結(jié)構(gòu)域在不同物種之間高度保守，HsBeclin-1 的 ECD結(jié)構(gòu)分析表明，ECD 結(jié)構(gòu)域是由 4 個 α 螺旋、3 對相互平行的 β 折疊和 6環(huán)形結(jié)構(gòu)共同形成的緊密球體，其顯著特征是其第四個環(huán)形結(jié)構(gòu)從主體突端具有 3 個連續(xù)的芳香氨基酸（見圖 1-4B）[40]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 陳小玲;黃志清;毛湘冰;吳秀群;吳彩梅;;Akirin基因的研究進(jìn)展[J];中國畜牧雜志;2012年13期

2 曾祥興;張馳;李康生;;無脊椎動物細(xì)胞免疫研究進(jìn)展[J];國際免疫學(xué)雜志;2009年05期

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本文編號：2823261