三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)廣泛分布于太平洋西部海岸的溫帶地區(qū),是東亞各國(guó)重要的海洋漁業(yè)資源,也是中國(guó)重要的養(yǎng)殖對(duì)象。在過去的十年中,中國(guó)三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,2014年其總產(chǎn)量已達(dá)到118836噸。然而,由于三疣梭子蟹養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)大以及繁殖調(diào)控技術(shù)的缺乏,優(yōu)質(zhì)的三疣梭子蟹的產(chǎn)量已不能滿足日益增長(zhǎng)的需求。繁殖調(diào)控技術(shù)的缺乏已經(jīng)成為制約該產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。近年來(lái),三疣梭子蟹的繁殖調(diào)控機(jī)制的研究越來(lái)越受到人們的重視。性腺是生物體進(jìn)行有性生殖產(chǎn)生配子的主要器官,有眾多調(diào)節(jié)因子參與了配子發(fā)生過程的調(diào)控。目前,甲殼類性腺發(fā)育和配子發(fā)生過程調(diào)控機(jī)制的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平,轉(zhuǎn)錄后水平的研究較少。miRNAs作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,其在性腺發(fā)育過程的功能得到了廣泛的關(guān)注。本研究分析了三疣梭子蟹繁殖相關(guān)miRNA及其合成通路的重要基因在性腺發(fā)育過程的功能,主要研究結(jié)果如下:1.MiRNA合成通路相關(guān)基因在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過程中的表達(dá)分析已知,Drosha、Exportin 5、Dicer 1和Argonaute 1(AGO 1)基因是miRNA合成通路的重要基因,而Dicer 2和Argonaute 2(AGO 2)則主要參與siRNA的合成調(diào)控。為研究上述基因在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過程中的功能作用,本實(shí)驗(yàn)利用RACE技術(shù)克隆了上述基因的cDNA全長(zhǎng)序列,同時(shí)進(jìn)行序列分析、同源分析和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),Drosha、Dicer 1和AGO 1在進(jìn)化上高度保守,與各自親緣關(guān)系較近的物種的蛋白質(zhì)序列相似度普遍較高(83%-99%),而Exportin 5、Dicer 2和AGO 2則保守性較低(序列相似度44%-51%)。對(duì)三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、ADO 1和ADO 2基因進(jìn)行組織差異性表達(dá)分析,結(jié)果顯示上述基因在各種組織中均表達(dá),且多種在肝胰腺或卵巢中高表達(dá),其次為精巢等。對(duì)各基因在精巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),Drosha、Exportin 5、Dicer 1和AGO 1基因的表達(dá)量均在II期達(dá)到最高,且各基因在不同時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致。Dicer 2和AGO 2均在I期高表達(dá)(P0.05),其他時(shí)期差異不大。在卵巢發(fā)育不同時(shí)期,Drosha與Exportin 5基因在卵巢發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量變化趨勢(shì)大致相同,都是隨著卵巢發(fā)育(從II期到V期)逐漸升高,在V期達(dá)到最大值(P0.05)。Dicer 1與AGO 1在各時(shí)期表達(dá)量變化趨勢(shì)也基本一致,從I期到III期表達(dá)量變化不大,IV期迅速上調(diào),V期達(dá)到峰值,VI期又迅速下調(diào)。Dicer 2與AGO 2在各時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)也基本一致,都是在II期和V期顯著高于其他時(shí)期(P0.05)。因此,我們推測(cè)Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因均參與了三疣梭子蟹性腺發(fā)育的調(diào)控,同時(shí)暗示miRNAs和siRNA可能在相應(yīng)時(shí)期發(fā)揮重要作用。2.三疣梭子蟹精巢和卵巢miRNA的鑒定與比較分析為研究miRNAs在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過程中的功能作用,對(duì)三疣梭子蟹性腺相關(guān)miRNAs進(jìn)行鑒定和分析。利用Illumina測(cè)序技術(shù),在卵巢和精巢中共識(shí)別了188個(gè)已知的和65個(gè)新的miRNAs。其中多個(gè)miRNA,如let-7、let-7c、let-7f,mir-2,mir-184和mir-276,在卵巢和精巢組織中均大量表達(dá),暗示其在性腺發(fā)育和功能發(fā)揮過程中的重要作用。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),75個(gè)miRNA在卵巢和精巢之間差異表達(dá)。同時(shí)KEGG分析發(fā)現(xiàn),這些miRNAs的靶基因顯著富集于幾種與繁殖相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如促性腺激素釋放激素信號(hào)通路,卵巢的類固醇和Wnt信號(hào)通路。進(jìn)一步的miRNA表達(dá)分析表明,某些miRNA在卵巢(mir-9,mir-125和mir-27a)和精巢(mir-7,mir-87和mir-2788)發(fā)育過程中的表達(dá)方式具有階段特異性。暗示它們?cè)谌嗨笞有沸韵侔l(fā)育不同時(shí)期發(fā)揮不同的功能。本研究結(jié)果將為甲殼類繁殖相關(guān)miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的進(jìn)一步研究提供重要參考。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2815068