近年來利用益生菌作為飼料添加劑是淡水魚類生態(tài)養(yǎng)殖上防控細(xì)菌性病害的有效新方法。本研究從海南三亞土壤中篩選獲得一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)新菌株,命名為戊糖片球菌SL001,并研究了該菌株的生物學(xué)特性、對(duì)草魚抗病性及生長(zhǎng)與免疫力的影響以及基因組特征,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:從海南三亞土壤中篩選到一株對(duì)魚類病原菌具有廣譜抑菌活性的乳酸菌,命名為SL001。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因測(cè)序鑒定,該菌株為戊糖片球菌(P.pentosaceus)新菌株。檢測(cè)了SL001菌株的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)魚類病原菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloide)及格式乳球菌(Lactococcus garvieae)均具有較好的抑菌效果。研究中發(fā)現(xiàn)SL001菌株細(xì)胞對(duì)80℃高溫、壯觀霉素等多種抗生素和氧氣具有一定的耐受性。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明,SL001菌株對(duì)草魚肝臟L8824細(xì)胞系無(wú)毒害作用。SL001菌株發(fā)酵上清液中,抑菌活性物質(zhì)對(duì)高溫和蛋白酶均不敏感,且乳酸濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加,最高可達(dá)12.4 mmol/L。乳酸含量為0.3 mL、6.14 mmol/L時(shí)的發(fā)酵液可完全抑制嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)。為了研究SL001菌株的益生功能,對(duì)草魚飼喂含有1×10~9 CFU/g SL001菌株的飼料30天。利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)草魚腸道微生物組測(cè)序分析的結(jié)果顯示,厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)是試驗(yàn)組和對(duì)照組中的優(yōu)勢(shì)菌群。潛在益生菌片球菌屬(Pediococcus)在試驗(yàn)組中的豐度顯著高于對(duì)照組,而試驗(yàn)組中潛在病原菌,如氣單胞菌屬(Aeromonas)和弧菌屬(Vibrio)的豐度顯著低于對(duì)照組,SL001菌株能在草魚腸道中穩(wěn)定定殖。飼喂SL001菌株30天后,草魚體重增長(zhǎng)率和比生長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組;對(duì)試驗(yàn)草魚的腸道組織HE染色分析,發(fā)現(xiàn)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收有關(guān)的杯狀細(xì)胞明顯增多,腸道絨毛顯著增長(zhǎng)。試驗(yàn)組草魚中肌肉抑制素(MSTN-1,MSTN-2)表達(dá)量顯著下調(diào),胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1,IGF-2)表達(dá)量顯著上調(diào)。試驗(yàn)組草魚血清中酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性均顯著高于對(duì)照組。試驗(yàn)組草魚肝臟、脾臟中IgM和補(bǔ)體C3的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,而IL8顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明SL001菌株能促進(jìn)草魚的生長(zhǎng)和提高其免疫力。攻毒試驗(yàn)表明,SL001菌株能顯著降低嗜水氣單胞菌感染后草魚的死亡率。對(duì)戊糖片球菌SL001基因組進(jìn)行分析,基因組全長(zhǎng)為1,919,175bp,由1,842,476 bp的核基因組和76,699 bp的質(zhì)粒基因組組成。預(yù)測(cè)到了1,889個(gè)CDS,2個(gè)CRISPR元件。借助COG、GO、KEGG功能注釋和RAST注釋,發(fā)現(xiàn)大部分基因與碳代謝、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝、核苷酸代謝以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)。通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn),在基因家族分析中,SL001菌株基因組和同種其他不同菌株存在明顯的差異;利用antiSMASH在線軟件分析了SL001菌株中次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇,有2個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇被預(yù)測(cè)到,其中一個(gè)基因簇與抗菌凝固素(coagulin)合成基因簇有40%的相似性,推測(cè)可能為抗菌凝固素中新成員。綜上所述,本研究分離篩選到的戊糖片球菌SL001菌株經(jīng)分類鑒定和基因組測(cè)序比較,顯示為一株新菌株,該菌對(duì)草魚抗病性顯示出很好的抗病作用,并能促進(jìn)草魚生長(zhǎng)和提高其免疫力。從基因組功能注釋發(fā)現(xiàn)可能含有抗菌凝固素生物合成基因簇,表明利用該菌株作為益生菌用于飼料添加劑在魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S942
【部分圖文】：

羅非魚、團(tuán)頭魴、大鯢、黃金卿魚、錦鯉等多種淡水魚類患病[9-11]，主要發(fā)狀為體表充血、局部潰爛、腹部腫大、肛口紅腫，解剖內(nèi)部器官腫大、顏色、腹腔嚴(yán)重積水、腸液黏連、腸道無(wú)食、腸壁充血，感染嚴(yán)重的魚各器官壞死胞發(fā)生溶血，難以分辨各器官[12, 13]。同時(shí)也有相關(guān)報(bào)道，這類細(xì)菌能夠引類和哺乳類的腹瀉和敗血癥，是人-魚共患的病原菌，對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大脅[14]。熒光假單胞菌可引起草魚、羅非魚、錦鯉、大鯢等多種水產(chǎn)動(dòng)物患病，病魚體表出現(xiàn)嚴(yán)重的出血、炎癥、鱗片脫落等癥狀[15-17]。湖南作為全國(guó)魚類養(yǎng)殖大省，以草魚養(yǎng)殖為主，“爛鰓病、腸炎病、赤皮病”和“細(xì)菌性癥、病毒性出血病、肝膽綜合征”分別被稱為草魚養(yǎng)殖中的“老三病”和“病”，這些病害一旦發(fā)生，極難控制，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[18]。貝類病害7%藻類病害3%棘皮類病害2%

一株新型戊糖片球菌的篩選及其對(duì)草魚抗病性的影響比較成熟，與其他種類益生菌相比，芽胞桿菌的芽胞具有耐高溫、耐酸堿、耐干燥等特點(diǎn)。我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖允許使用的芽胞桿菌主要有枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、貝萊斯芽胞桿菌、東洋芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌等[40]。Yi 等人從健康草魚中篩選了一株貝萊斯芽胞桿菌，通過研究，該菌株對(duì)魚類病原菌具有廣譜的抑菌活性，同時(shí)能誘導(dǎo)魚體免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，刺激魚體的免疫應(yīng)答，對(duì)魚類具有保護(hù)作用[41]。曹海鵬的研究證實(shí)了解淀粉芽胞桿菌能夠治療嗜水氣單胞菌引起的草魚細(xì)菌性敗血癥[42, 43]。楊麗莉等研究了枯草芽胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌對(duì)脂肽類物質(zhì)具有較高的敏感性，豐富了枯草芽胞桿菌的抑菌機(jī)理[44]。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖用乳酸菌和酵母菌的研究較少，因此開發(fā)新的水產(chǎn)動(dòng)物功能微生物來降低水產(chǎn)養(yǎng)殖病害損失和提高水產(chǎn)品質(zhì)量迫在眉睫。

一株新型戊糖片球菌的篩選及其對(duì)草魚抗病性的影響長(zhǎng)（圖 1-3）[56]。小片球菌 2.6 菌株產(chǎn)生 β-葡聚糖，能幫助菌體定殖于魚類腸道，限制病原菌鰻弧菌吸附于腸道[39]。另外，當(dāng)乳酸菌進(jìn)入腸道后，利用宿主攝入食物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖，并和病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)從而限制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)消耗氧氣，使好氧病原菌無(wú)法生長(zhǎng)[19]。所以，乳酸菌等益生菌能代替抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖防控病害。

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