鯉皰疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II,CyHV-2)是鯉皰疹病毒屬中一種具有強致病力的DNA病毒。近年來,由CyHV-2引起的異育銀鯽鰓出血病在江蘇鹽城地區(qū)大規(guī)模爆發(fā),致死率特別高,給異育銀鯽的養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失,生產(chǎn)上亟待開發(fā)安全高效的新型疫苗,應(yīng)用于異育銀鯽鰓出血病防治。1.CyHV-2新型疫苗的免疫效果評估本研究中基于桿狀病毒表面展示系統(tǒng)構(gòu)建了CyHV-2的ORF72與ORF66重組疫苗、CyHV-2的ORFD4核酸疫苗,并評估它們抗CyHV-2的免疫效果。將CyHV-2_ORF72基因與CyHV-2_ORF66基因分別克隆進桿狀病毒表面展示載體pFastBac~(TM)Dual-P10-GP64CTD載體中,通過Bac to Bac系統(tǒng)獲兩種重組病毒,命名為BmNPV-P10-GP64-ORF72與Bm NPV-P10-GP64-ORF66。以1.0×10~(10)TU/尾的病毒量分別腹腔注射免疫異育銀鯽(體長7~13cm,體重35-60g),同設(shè)免疫等體積的生理鹽水作空白對照組,免疫后第3周通過競爭型酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血液中抗體的效價水平。結(jié)果顯示免疫組(2組)與對照組抗體效價水平?jīng)]有明顯差異。表明基于桿狀病毒表面展示系統(tǒng)構(gòu)建的CyHV-2的ORF72與ORF66重組疫苗免疫異育銀鯽后,機體均沒有產(chǎn)生較高水平的特異性應(yīng)答。因此,選取CyHV-2(GenBank:KT387800)的衣殼蛋白(ORF66、ORF72)和膜囊蛋白(ORF81、ORF82)作為候選疫苗蛋白,通過抗原表位預(yù)測后,將ORF66、ORF72、ORF81、ORF82的抗原表位對應(yīng)的DNA序列串聯(lián),將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的序列克隆在β-肌動蛋白啟動子下游,構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體,通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組病毒,命名為BmNPV-FA-D4ORF。分別以注射和口服的方式免疫異育銀鯽(體長7~13cm,體重35-60g)。Bm NPV-FA-D4ORF通過腹腔注射免疫異育銀鯽(2.2×10~(13)TU/尾),同設(shè)BmNPV為陰性對照及空白對照組(等體積生理鹽水/尾)。在魚免疫后第1、2、3周通過PCR、RT-PCR的方法檢測免疫魚體中相關(guān)疫苗基因的DNA、RNA水平;免疫后第1、2周后,通過免疫組化的方法檢測免疫魚體脾臟、腎臟中疫苗基因蛋白水平的表達;免疫后第1、2、3、4周分別通過競爭型-ELISA檢測抗體效價水平;免疫后第3周接種CyHV-2,評估免疫效果。結(jié)果顯示,BmNPV-FA-D4ORF注射魚體后能夠進入魚組織,表達疫苗蛋白,并刺激魚產(chǎn)生特異性抗體,抗體水平在注射后的第三周達到最高水平。攻毒后,免疫組、陰性對照組、空白對照組的鰓出血病的發(fā)病率分別為7.69%、29.17%、38.46%。滴度為2.2×10~(11)TU/ml的Bm NPV-FA-D4ORF以1ml/g噴灑魚顆粒飼料(對照組中添加等體積生理鹽水),飼喂異育銀鯽,4周后,人工感染CyHV-2免疫組、空白對照組的鰓出血病的發(fā)病率分別為15.38%、25.93%。表明BmNPV-FA-D4ORF通過注射和口服的方式免疫,均對異育銀鯽鰓出血病有良好的免疫保護作用。將異育銀鯽浸泡免疫在500拷貝的BmNPV-FA-D4ORF/μl的水中,5h后取鰓、脾臟、血液進行RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)浸泡免疫魚的脾臟、脾臟、血液中均檢測到了疫苗基因表達,表明BmNPV-FA-D4ORF可以通過浸泡進入魚體,并表達疫苗基因,暗示BmNPV-FA-D4ORF可以通過浸泡免疫異育銀鯽。2.CyHV-2的ORF72蛋白卵黃抗體的制備為了探討卵黃抗體應(yīng)對異育銀鯽鰓出病的防治效果,將CyHV-2的ORF72基因克隆進PET28+(a)的載體中,然后在大腸桿菌中進行表達,SDS-PAGE和Western-blot檢測結(jié)果顯示,ORF72在大腸桿菌中成功表達,表達水平較高。篩選出高表達陽性克隆菌,再接種至發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)后,收集菌體,通過破碎、變性、復(fù)性、過Ni柱、洗脫、透析等一系列過程,從大腸桿菌中純化獲得可溶性的ORF72蛋白;通過免疫雞群,收雞蛋制備蛋粉共獲蛋粉約100千克。Western-blot檢測結(jié)果顯示,蛋粉中含有特異性的ORF72抗體,ELISA檢測結(jié)果顯示,蛋粉中的抗體效價在1:8000-16000,為測試卵黃抗體在鰓出血病防控中的效果奠定了基礎(chǔ)。3.異育銀鯽鰓出病魚卵中的CyHV-2的檢測基于CyHV-2的解旋酶基因(helicase)設(shè)計了引物,建立real time PCR檢測CyHV-2的技術(shù)。對患病異育銀鯽不同組織的檢測結(jié)果顯示,異育銀鯽的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、鰓的感染CyHV-2的程度存在顯著差異,腎臟感染程度最高,其次是脾臟和鰓,心臟的感染程度最低。魚卵逐粒檢測結(jié)果顯示,病魚的魚卵中,有12.5%可檢測到CyHV-2。病魚的魚卵的集團檢測結(jié)果顯示,帶毒量為3.31拷貝的病毒/粒魚卵。對不同感染程度的病魚的魚卵檢測結(jié)果顯示,卵中CyHV-2的檢出水平與魚的感染程度呈一定的弱正相關(guān)性。這些結(jié)果表明CyHV-2可通過卵垂直傳遞給子代。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S941.41
【部分圖文】：

鯉皰疹病毒 II 型的 DNA 疫苗、卵黃抗體的研制及魚卵中鯉皰疹病d-GP64-ORF66。為了驗證重組 Bacmid 中具有 ORF72 和 OR物對 Bacmid-GP64-ORF72 和 Bacmid-GP64-ORF66 進行 PCR以從 Bacmid-GP64-ORF72 和 Bacmid-GP64-ORF72 擴增出與異性條帶（圖 1），分別為泳道 2 轉(zhuǎn)化菌與泳道 4 轉(zhuǎn)化菌，說重組至 Bacmid 中。

-P10-GP64-ORF72、Bacmid-P10-GP64-ORF66 轉(zhuǎn)染 BmN 下觀察細胞和轉(zhuǎn)染 Bacmid-P10-GP64-ORF72 的 BmN 細胞，B：正常 BmBacmid-P10-GP64-ORF66 的 BmN 細胞 Western 檢測重組蛋白 ORF72、ORF66 在病毒粒子中的：Bacmid-P10-GP64-ORF72 轉(zhuǎn)染 BmN 細胞后 3d 收上清超速離心kDa

23測重組蛋白 ORF72、ORF66 在10-GP64-ORF72 轉(zhuǎn)染 BmN 細胞后 ORF66 轉(zhuǎn)染 BmN 細胞后 3d 收上清鼠抗，CyHV-2-ORF66 自制鼠抗；鼠P64-ORF72 與 BmNPV-P10-GP4-ORF72 與 BmNPV-P10-GP64-的魚血作陰性對照，通過反競

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本文編號：2814247