凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是我國(guó)對(duì)蝦的主養(yǎng)殖品種,隨著養(yǎng)殖的深入開(kāi)展,其產(chǎn)量近幾年高居世界首位,為我國(guó)沿海乃至內(nèi)陸地區(qū)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)。然而,產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也伴隨著病害的發(fā)生。本文主要針對(duì)一種新型的對(duì)蝦細(xì)菌性白斑病(Bacterial white spot disease,BWSD)進(jìn)行了深入研究。2015~2016年,對(duì)浙江、河北、山東、江蘇、天津五省市共9地區(qū)出現(xiàn)白斑癥狀的凡納濱對(duì)蝦150余口養(yǎng)殖池進(jìn)行了調(diào)查,出現(xiàn)白斑癥狀的對(duì)蝦檢出率達(dá)84.7%。對(duì)調(diào)查中存在白斑癥狀的對(duì)蝦進(jìn)行取樣,參照GB/T 28630.2-2012白斑綜合癥(WSD)診斷規(guī)程中套式PCR檢測(cè)法,進(jìn)行WSSV檢測(cè)排查,各地甲殼上具有明顯白斑的患病對(duì)蝦均未被WSSV感染。調(diào)查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水溫在26℃以上均有細(xì)菌性白斑病的發(fā)生,其發(fā)生不受養(yǎng)殖模式的影響,室外大塘、室外高位池、室外保溫棚以及室內(nèi)循環(huán)水工廠化四種主要養(yǎng)殖模式中均有檢出。由于凡納濱對(duì)蝦一年四季均有養(yǎng)殖,養(yǎng)殖水溫在26℃以上,故細(xì)菌性白斑病在一年四季均可發(fā)生。肉眼觀察下,患細(xì)菌性白斑病(BWSD)對(duì)蝦頭胸甲出現(xiàn)的白色斑點(diǎn)與對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)感染后的白斑極為相似,但不同的是,患細(xì)菌性白斑病初期,對(duì)蝦健康狀況良好,生長(zhǎng)基本正常,活力比較旺盛,未出現(xiàn)明顯死亡現(xiàn)象,而患病毒性對(duì)蝦白斑綜合征屬急性死亡,2~3天內(nèi)死亡率可達(dá)100%。由于養(yǎng)殖業(yè)者缺少區(qū)分細(xì)菌性白斑病和病毒性白斑綜合征的技術(shù),當(dāng)白斑發(fā)生時(shí)往往采取消極措施,甚至緊急排塘,結(jié)束養(yǎng)殖,造成不必要的損失。本文對(duì)細(xì)菌性白斑病的組織病理學(xué)進(jìn)行了研究。光學(xué)顯微鏡下觀察,細(xì)菌性白斑呈圓形,具明顯輻射肋,由白斑中心延伸至鋸齒狀的邊緣;白斑的中心處通常呈暗褐色,后期此處蝦殼被侵蝕穿孔;而由WSSV感染引起的白斑呈圓形,邊緣光滑、規(guī)則,圓形中密集分布大量黑色小斑點(diǎn),無(wú)明顯中心。細(xì)菌性白斑病白斑處的組織病理學(xué)研究顯示,白斑中心蝦殼被細(xì)菌破壞、分解,殼下充滿大量組織碎片和細(xì)菌,上皮組織以及結(jié)締組織被嚴(yán)重破壞、侵蝕,出現(xiàn)斷裂,最終在整體結(jié)構(gòu)上形成明顯凹陷與斷層;高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn),斷裂的上皮組織與結(jié)締組織得細(xì)胞核呈嗜堿性深染,殼下上皮組織與結(jié)締組織伴有炎癥、甚至壞死。電子顯微鏡下,細(xì)菌性白斑中心區(qū)域甲殼被細(xì)菌侵蝕,出現(xiàn)穿孔,穿孔四周甲殼呈絮狀,并有大量的桿狀細(xì)菌黏著、積聚。同時(shí),白斑周?chē)慕】导讱ひ灿写罅織U狀細(xì)菌附著。研究結(jié)果為區(qū)分細(xì)菌性和病毒性白斑奠定了基礎(chǔ)。本研究從浙江、山東(2015年)、河北、天津、江蘇和山東(2016年)患病對(duì)蝦樣品中的頭胸甲白斑中心區(qū)域分離獲得6株優(yōu)勢(shì)度達(dá)80%以上的優(yōu)勢(shì)菌,編號(hào)分別為ZJ201506、SD201508、HB201509、TJ201509、JS201510、SD201601。通過(guò)革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)以及基于16s rDNA與基于gyr B的序列分析最終確定6株優(yōu)勢(shì)菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)或其后期異型菌貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis);藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:6株優(yōu)勢(shì)菌對(duì)氧氟沙星、菌必治、頭孢氨芐、蓋博斯林、苯唑青霉素、頭孢噻肟高度敏感;對(duì)青霉素、利福平、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素不敏感。利用菌株JS201506對(duì)健康的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行浸浴感染,浸浴濃度為5×102~5×106cfu/mL。同時(shí)設(shè)置創(chuàng)傷浸浴感染實(shí)驗(yàn)組,使用解剖刀對(duì)受試對(duì)蝦甲殼進(jìn)行創(chuàng)傷處理,以留下劃痕不穿透為原則,創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)組浸浴濃度為5×104cfu/mL和5×105cfu/mL。結(jié)果顯示,實(shí)際檢測(cè)濃度為2×104cfu/mL感染組的受試對(duì)蝦于27d出現(xiàn)與自然患病對(duì)蝦相同的早期細(xì)菌性白斑;檢測(cè)濃度為6.7×105cfu/mL感染組和9.1×105cfu/mL感染組分別在12d和10d出現(xiàn)早期白斑,在29d和25d時(shí)出現(xiàn)中、后期白斑。創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦頭胸甲上均出現(xiàn)了沿創(chuàng)傷部位生長(zhǎng)的白斑,且白斑較為明顯,以上患病對(duì)蝦均表現(xiàn)出活力正常,攝食狀況良好,未出現(xiàn)明顯死亡。因此,當(dāng)水體中的解淀粉芽孢桿菌濃度高于104cfu/mL時(shí),對(duì)蝦存在感染細(xì)菌性白斑病的風(fēng)險(xiǎn)。從回感患病對(duì)蝦白斑中心區(qū)域進(jìn)行細(xì)菌分離得到一株優(yōu)勢(shì)度為87.1%的細(xì)菌,該菌革蘭氏陽(yáng)性,桿狀,具芽孢。通過(guò)生理生化和16s r DNA的序列分析得出結(jié)論,分離的優(yōu)勢(shì)菌與菌株JS201506為同一株菌。本研究使用市場(chǎng)銷售的3種不同品牌的以芽孢桿菌為主要成分菌的微生態(tài)制劑粉末充氧活化后,對(duì)健康凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行高濃度浸浴實(shí)驗(yàn),施用量按照指導(dǎo)用量的4~5倍。結(jié)果顯示:3種微生態(tài)制劑感染受試健康對(duì)蝦分別在16d、20d和18d時(shí),甲殼出現(xiàn)了典型的細(xì)菌性白斑癥狀,而受試對(duì)蝦攝食狀態(tài)良好,未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此,市售以芽孢桿菌為主要成分菌的微生態(tài)制劑高濃度施用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌性白斑病,故養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)合理的使用微生態(tài)制劑。綜上,本文研究病毒和細(xì)菌兩種對(duì)蝦白斑癥狀的不同,正確的區(qū)分了細(xì)菌性白斑病與病毒性白斑綜合征,對(duì)開(kāi)展對(duì)蝦健康養(yǎng)殖和相關(guān)病害防控具有重要的指導(dǎo)意義。通過(guò)對(duì)浙江、山東、河北、天津、江蘇五省市對(duì)蝦細(xì)菌性白斑病調(diào)查和致病原分析,發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌或其后期異型菌貝萊斯芽孢桿菌是的主要致病原,并且該病的發(fā)生與以芽孢桿菌為主要成分菌的微生態(tài)制劑過(guò)量施用存在關(guān)聯(lián)。同時(shí),本論文所得結(jié)論也為提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的生態(tài)安全意識(shí)和正確使用微生態(tài)制劑提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S945.49

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本文編號(hào)：2813561