溶藻弧菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌,屬于弧菌屬,廣泛存在于湖泊和海水中,可以導(dǎo)致魚類的潰瘍病,嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡,是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的病原菌。此外,還可通過受染海產(chǎn)品食用等方式危害人類健康,引發(fā)食品安全問題。目前已鑒定的溶藻弧菌主要致病因子有脂多糖、鞭毛、生物被膜、鐵載體、胞外蛋白酶、外膜蛋白等。當(dāng)前對于溶藻弧菌病害的防治仍然以抗生素為主,其大量使用容易使溶藻弧菌易產(chǎn)生耐藥性,且存在藥物殘留等問題,因此亟需尋求一種綠色安全的防治手段。在細(xì)菌體內(nèi)大量存在一種非編碼的sRNA,可以快速合成并通過堿基配對的方式對靶標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,影響靶標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性,廣泛參與細(xì)菌的生理進(jìn)程,而目前關(guān)于溶藻弧菌體內(nèi)的細(xì)胞密度相關(guān)型的sRNA分子的鑒定及功能研究僅有Qrr1-5五個,未見其他報道。本課題利用高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)手段對不同細(xì)胞密度下溶藻弧菌體內(nèi)差異表達(dá)sRNA分子進(jìn)行篩選與鑒定,選取其中5個在不同細(xì)胞密度下差異表達(dá)最為顯著的sRNA分子,分別命名為655,662,665,669,678,利用無標(biāo)記缺失框手段構(gòu)建缺失株,并利用回補(bǔ)質(zhì)粒pBAD33構(gòu)建相應(yīng)的回補(bǔ)株,并進(jìn)一步探究其對溶藻弧菌不同生理功能的影響,為安全有效的綠色防治手段提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:(1)通過RNA-Seq高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),同時結(jié)合生物信息學(xué)手段,對低密度和高密度培養(yǎng)下的溶藻弧菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選得到146條sRNA分子,差異表達(dá)的sRNA一共有82個,其中高密度條件下較低密度上調(diào)表達(dá)的sRNA分子共47個,下調(diào)表達(dá)的sRNA分子共35個。并從中篩選五個表達(dá)差異較為顯著的sRNA(655,662,665,669,678)作為研究對象,其中有3個上調(diào)表達(dá),2個下調(diào)表達(dá),均為新型sRNA分子,都具有啟動子區(qū)域和終止子區(qū)域。熒光定量PCR結(jié)果也證明這5種sRNA分子全部真實存在。利用MFold對5種sRNA分子的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示5種sRNA分子二級結(jié)構(gòu)均具有RNA二級結(jié)構(gòu)的典型特征,包含不同數(shù)量典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu),在莖環(huán)臨近處含有富含AU堿基的假定Hfq結(jié)合位點區(qū),莖狀結(jié)構(gòu)區(qū)的堿基組成相對保守。利用Target RNA2對5種sRNA分子進(jìn)行靶標(biāo)mRNA的預(yù)測,結(jié)果顯示不同的sRNA分子在溶藻弧菌基因組中均具有數(shù)十個靶標(biāo)mRNA分子,且所涉及的生理功能也不盡相同。(2)利用無標(biāo)記缺失突變株法成功構(gòu)建分別缺失114bp的Δ678,298bp的Δ665,142bp的Δ669,221 bp的Δ655,106 bp的Δ662等5個缺失株。通過構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒成功得到5個回補(bǔ)菌株。在成功構(gòu)建得到菌株之后,從生長特性、運(yùn)動性、生物被膜、胞外多糖等方面進(jìn)行其功能的研究,結(jié)果表明:5種細(xì)胞密度相關(guān)sRNA分子對溶藻弧菌的生長具有不同程度的影響,其中655最為顯著,該sRNA的缺失使得溶藻弧菌的生長受到顯著的抑制,其次為665,678,669,而662影響則相對較小。5種sRNA對于溶藻弧菌的游動性和爬動性均具有一定的促進(jìn)作用,在基因缺失之后,其運(yùn)動能力明顯受到限制,對基因進(jìn)行回補(bǔ)之后,其運(yùn)動能力均有一定回復(fù),但仍沒有回復(fù)到野生型水平。對于爬動能力的調(diào)控主要通過對周生鞭毛合成蛋白LafK和LafA的激活作用來實現(xiàn);而對于游動能力的影響,則主要通過對極生鞭毛合成相關(guān)蛋白FliS和FlaK的作用來實現(xiàn)。其中,669對于溶藻弧菌的運(yùn)動能力的調(diào)控作用最為明顯。5種sRNA對于溶藻弧菌生物被膜的形成也具有一定的促進(jìn)作用,且通過對生物被膜調(diào)控因子SypG的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用實現(xiàn)。5種sRNA對于溶藻弧菌胞外多糖的合成均具有一定的正向調(diào)控作用,其中665對溶藻弧菌胞外多糖的產(chǎn)生具有非常顯著的調(diào)控作用。此外,這5種sRNA還對溶藻弧菌抗生素敏感性具有不同的調(diào)控作用,但對環(huán)境應(yīng)激能力的作用不明顯。(3)5種sRNA對溶藻弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)核心元件LuxR和AphA具有不同的調(diào)控作用,首先通過Western blot檢測得知,665、662、655對LuxR蛋白表達(dá)無明顯作用,669和678對LuxR蛋白表達(dá)有一定的促進(jìn)作用,通過RT-PCR結(jié)果得知:在菌株Δ655、Δ665和Δ662中,LuxR的mRNA水平相比野生型分別上調(diào)1.17、1.57以及0.57倍,在Δ669、Δ678菌株中,LuxR的mRNA水平相比野生型分別下調(diào)5.18和5.65倍,即669和678對LuxR的mRNA水平有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。在菌株Δ655、Δ665和Δ662中,AphA的mRNA水平相比野生型均為下調(diào),Δ669、Δ678菌株中,AphA的mRNA水平相比野生型均為上調(diào),表明669和678對AphA有抑制作用。同時5個sRNA分子對上游元件LuxU和LuxO具有一定的正向調(diào)控作用,即sRNA通過群體感應(yīng)系統(tǒng)實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的精準(zhǔn)調(diào)控。通過本研究將進(jìn)一步豐富人們對溶藻弧菌毒力調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識,為后續(xù)溶藻弧菌病害新型防治手段的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：陜西科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S941.42
【部分圖文】：

圖 1-1 sRNA-mRNA 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)示意圖-1 Schematic representation of the sRNA-mRNA mediated regulatorythe mRNA targets;Yellow box: sRNA; Blue circles: the regulaators; Green lines: upregulation of target gene; Red lines: indicates th酸酶至靶標(biāo) mRNA 分子影響其穩(wěn)定性。下面對 sRNA 分機(jī)制進(jìn)行闡述。制靶基因表達(dá)的作用機(jī)制的大多數(shù)sRNA分子對其靶標(biāo)mRNA分子表達(dá)水平的影用，作用機(jī)制包括以下幾種：NA 分子的 RBS 結(jié)合靶標(biāo) mRNA 分子的 RBS 區(qū)進(jìn)行堿基配對，從而阻止 3起始，如圖 1-2a[47]。大多數(shù)已深入研究的 sRNA 分子通碼子來抑制靶標(biāo) mRNA 的翻譯。然而系統(tǒng)的反義掃描研mRNA 分子第五個密碼子后的序列發(fā)揮其翻譯抑制作用，

陜西科技大學(xué)碩士學(xué)位論文'UTR 的位點相互作用阻礙了 30S 核糖體進(jìn)入，而與第二個結(jié)合招募 RNaseE 使得 RyhB：msrB 降解。大量的 sRNA RNA 分子的 SD 序列結(jié)合，如 ptsG mRNA 分子 SD 序列中 分子 SgrS 對其抑制作用便完全去除。在大腸桿菌內(nèi)，目A，如 Spot42:galK，GcvB:oppA，DsrA:hns，MicF:ompF

”sRNA 配對可使得 mRNA 上的這種翻譯抑制結(jié)構(gòu)打開，從而釋放核糖體行蛋白質(zhì)合成[67,68]。金黃色葡萄球菌表達(dá)一個大小約為 500nt 的 sRNA，R群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，可通過其 5’末端與靶標(biāo) hla mRNA 分子 SD 序列中的進(jìn)行堿基配對來消除翻譯抑制結(jié)構(gòu)的形成，從而激活 hla mRNA 分子的翻偶聯(lián)激活些 sRNA 分子可通過與靶標(biāo)基因 5’UTR 堿基配對正向調(diào)控其 ORF 表達(dá)，該 ORF 翻譯偶聯(lián)的來自不同順反子的 mRNA 的翻譯。銅綠假單胞菌中氧 sRNA，PhrS 在厭氧條件下對 ufo-pqsR 操縱子的激活作用便遵循該作用機(jī)下，PhrS 過量表達(dá)后可與 ufo 的 5’UTR 相互作用而改變其二級結(jié)構(gòu)，使得釋放，從而促進(jìn)其翻譯以及與之偶聯(lián)反義的 pqsR 的翻譯。NA 誘餌作用除作為抑制子的 sRNA 可激活其靶標(biāo) mRNA 的翻譯，某些含有堿基配對能A 沉默序列的 RNA 分子能夠與靶標(biāo) mRNA 分子間競爭性地結(jié)合 sRNA 分 sRNA 分子對于靶標(biāo) mRNA 分子的抑制作用被去除，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成示。

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本文編號：2811347