淋巴細胞抗原75(Ly75)是一種Ⅰ型跨膜表面蛋白,屬于C型凝集素超家族中甘露糖受體家族成員。已有研究表明Ly75在魚類的性腺中表達量比較高,且只在特異的生殖細胞中表達。為了解Ly75在尼羅羅非魚(Oreochromis nilotcus)中的功能,本研究采用RACE技術(shù)克隆了尼羅羅非魚Ly75基因(OnLy75)的cDNA全序列,運用qPCR技術(shù)分析了該基因在健康尼羅羅非魚中的組織分布。并構(gòu)建了其原核表達載體,獲得了具有免疫原性的On Ly75重組蛋白,用重組蛋白免疫新西蘭大耳白兔后獲得了兔抗On Ly75多克隆抗體。另外,還運用原位雜交技術(shù)定位了該蛋白在尼羅羅非魚精巢組織的具體表達位置。主要研究結(jié)果如下:1尼羅羅非魚Ly75基因的克隆和組織表達以NCBI上On Ly75的預(yù)測序列為模板設(shè)計引物,獲得中間片段序列,采用RACE技術(shù)克隆On Ly75基因的cDNA全序列。成功獲得了6632 bp的OnLy75cDNA全序列,其開放閱讀框長5199 bp,編碼1732個氨基酸。ProtParam軟件分析On Ly75蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果顯示其蛋白分子量為196.5千道爾頓(kDa),理論等電點為6.41,不穩(wěn)定指數(shù)是38.17,屬于穩(wěn)定蛋白;親水性平均指數(shù)為-0.476,屬于親水性蛋白。SMART軟件在線分析OnLy75蛋白的保守結(jié)構(gòu)域從N端到C端依次為:一個CysR、一個FNⅡ、十個CTLDs和一個TM。氨基酸序列同源性分析表明,On Ly75與金槍魚Ly75的同源性最高(相似性86.0%,同一性64.9%),與其他魚類也有較高的同源性(相似性75.3%~85.0%,同一性49.3%~62.3%)。NJ系統(tǒng)進化樹分析顯示OnLy75分布于Ly75分支,屬于甘露糖受體亞家族成員。qPCR分析OnLy75基因在健康尼羅羅非魚組織中的表達,結(jié)果顯示On Ly75在所檢測的各組織中都有表達且表達差異明顯。其中在精巢組織表達量最高,其次是腸道、胸腺、后腎、鰓、脾臟、頭腎、中腎和腦,在心臟、肌肉和卵巢表達量較低,而表達量最低的是皮膚和肝臟組織。根據(jù)所得的On Ly75 cDNA序列,設(shè)計引物,制備了用于原位雜交的Ly75正義探針和反義探針。利用切片原位雜交技術(shù),分析了On Ly75在精巢組織中的表達位置。2尼羅羅非魚Ly75的原核表達及多克隆抗體制備選取On Ly75抗原性良好的多肽序列,設(shè)計構(gòu)建原核表達載體的引物,以8.5日齡的尼羅羅非魚總cDNA為模板,擴增構(gòu)建On Ly75原核表達片段,將其連接到原核表達載體pEASY-E2中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEASY-E2-On Ly75。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,用IPTG進行誘導(dǎo)表達,誘導(dǎo)表達條件為IPTG 0.5 mmol/L、37℃、誘導(dǎo)表達5 h。誘導(dǎo)表達后SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)On Ly75重組蛋白主要存在于包涵體中。用純化后的OnLy75重組蛋白多次免疫新西蘭大耳白兔后,取抗血清,經(jīng)親和純化后獲得兔抗OnLy75多克隆抗體。使用該多抗對尼羅羅非魚不同器官進行Western blot內(nèi)源性檢測,結(jié)果顯示該蛋白在精巢中有豐富的表達,表明兔抗On Ly75多克隆抗體制備成功。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2811274