發(fā)布時間：2020-08-26 18:09

【摘要】：本文以分離自患病養(yǎng)殖鱸鯉的類志賀鄰單胞菌為研究對象。自發(fā)病鱸鯉體內(nèi)明顯病灶處分離后,選擇優(yōu)勢菌純化保存待用。利用常規(guī)生理生化、分子生物學(xué)和API微生物系統(tǒng)對其分類學(xué)地位進行綜合鑒定,對主要受損器官肝臟和腸道開展病理學(xué)研究,并進行攻毒感染驗證性試驗,同時進行常用抗生素藥物的篩選,為發(fā)病鱸鯉的病因及防治提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.分離和初步鑒定。對批次患病鱸鯉的細菌性疾病病原菌進行研究:自瀕死鱸鯉個體肝臟及腎臟等部位分離得到菌株后經(jīng)純培養(yǎng)得到一株致病菌(編號為LLS1);以攻毒感染實驗結(jié)果判定為致病菌;經(jīng)革蘭氏染色、葡萄糖發(fā)酵及氧化酶等生理生化反應(yīng),初步認(rèn)定菌株為革蘭氏陰性桿菌,葡萄糖發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,氧化酶實驗反應(yīng)為陽性。2.API微生物鑒定系統(tǒng)。采用法國API自動微生物鑒定系統(tǒng)對分離純化致病菌株進行鑒定,以嗜水氣單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株為質(zhì)控菌。結(jié)果顯示:對質(zhì)控嗜水氣單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966以及分離致病菌株LLS1的鑒定結(jié)果均有較高的可信度,其鑒定值均大于99%(分別為99.80%、99.90%),符合率分別為0.64和0.72(T≥0.50)。ATCC7966標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定結(jié)果為嗜水氣單胞菌,LLS1菌株的鑒定結(jié)果為類志賀鄰單胞菌。3.分子生物學(xué)分析。采用16S rRNA、23S rRNA和gyrB三個基因的序列,綜合對分離菌株進行分類地位的鑒定。通過引物設(shè)計與PCR擴增,最終獲得的分子序列以構(gòu)建NJ分子進化樹,結(jié)果顯示16S rRNA、23S rRNA和gyrB各基因片段所擴增出的片段長度分別為1400bp、280bp、1100bp的條帶,其大小與目標(biāo)條帶預(yù)期大小相符;進化樹分析顯示各基因均與類志賀鄰單胞菌聚為一支,并有較高的置信度。4.組織病理學(xué)。以攻毒感染實驗中具有典型病癥的瀕死鱸鯉為研究對象,解剖獲取肝臟和腸道組織,固定后經(jīng)組織切片處理。肝臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果主要癥狀:炎性細胞呈現(xiàn)灶性聚集,聚集處附近細胞結(jié)構(gòu)不清晰,邊界模糊;細胞變性壞死,細胞核核質(zhì)濃縮、核膜邊緣不規(guī)則收縮,部分肝細胞呈空泡樣、細胞核溶解消失;組織疏松、水腫;血竇周圍有細胞變性壞死;組織結(jié)構(gòu)被破壞。腸道組織病理學(xué)觀察結(jié)果主要有:腸絨毛內(nèi)壁出血;絨毛上皮缺失;絨毛內(nèi)充血;絨毛處有明顯空泡樣;炎癥表現(xiàn),有絨毛脫落破碎化分布。5.藥敏試驗。本研究利用K-B紙片擴散法檢測患病鱸鯉中分離的類志賀鄰單胞菌株對17種常見抗生素類藥物的敏感性。結(jié)果表明分離類志賀鄰單胞菌菌株對強力霉素、慶大霉素、先鋒霉素V、氯霉素等4種藥物呈現(xiàn)敏感反應(yīng);對環(huán)丙氟哌酸、氟哌酸、紅霉素等3種藥物呈中度敏感反應(yīng);對四環(huán)素、鏈霉素、恩諾沙星、氨芐西林、哌拉西林、青霉素、磺胺異VA唑、氟苯尼考、利福平、萬古霉素等10種藥物具有抗性。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S943
【圖文】：

圖 2-1 分離菌株 LLS1 在 SS（a）、普通營養(yǎng)瓊脂（b）培養(yǎng)基中生長特征Fig.2-1 Isolated strain LLS1 on SS（a）、General nutrition agar（b）患病個體癥狀主要表現(xiàn)為前期：出現(xiàn)輕度浮頭及離群游動，游動緩慢，攝食減少；中期：完全停止進食，眼球輕微突出，下頜以及腹部輕微出血，鰭條發(fā)紅；后期：陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，腹部出血及膨脹現(xiàn)象。解剖后觀察發(fā)現(xiàn)死亡魚體腹腔內(nèi)都不同程度的出現(xiàn)少許積液（即腹水）；肝臟腫大，顏色淡黃且有不規(guī)則分布的紅點分布其上，用解剖針插入，感覺組織輕微松脆似豆沙狀；鰓部輕者炎癥，重者出現(xiàn)糜爛及爛鰓并伴有腮部出血的癥狀。

圖 2-2 患病鱸鯉的癥狀a 患病致死鱸鯉；b 腹部出血；c 鰓部霉變；d 爛鰓及鰓部出血 2-2 Onset symptoms of Percocypris pingi pingi（Tchang） a.death Percocyprishang） b. abdominal hemorrhage c. gill grows mildew d. rotten gills and gills b離菌株的生化鑒定初步結(jié)果糖發(fā)酵及氧化酶結(jié)果顯示（見圖 2-3），分離菌株為發(fā)酵型（葡萄糖果為產(chǎn)酸不產(chǎn)氣），氧化酶實驗（即細胞色素氧化酶）反應(yīng)為陽性（

圖 2-2 患病鱸鯉的癥狀病致死鱸鯉；b 腹部出血；c 鰓部霉變；d 爛鰓及鰓部 symptoms of Percocypris pingi pingi（Tchang） a.death P abdominal hemorrhage c. gill grows mildew d. rotten gills a生化鑒定初步結(jié)果氧化酶結(jié)果顯示（見圖 2-3），分離菌株為發(fā)酵型不產(chǎn)氣），氧化酶實驗（即細胞色素氧化酶）反應(yīng)

【參考文獻】

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本文編號：2805519