【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國重要的淡水育珠蚌,是我國珍珠產(chǎn)業(yè)的首選貝類。珍珠光滑有光澤,但實際出的珍珠良莠不齊,關(guān)鍵是珠質(zhì)沉積所致。。而珠質(zhì)的主要成分為碳酸鈣(CaCO3)。為了探究形成碳酸鈣結(jié)晶的鈣離子在體外的來源,在體內(nèi)的轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)運(yùn)及合成,本實驗一方面使用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合鈣離子探針檢測在插核120天期間不同時期內(nèi)不同鈣離子濃度環(huán)境下外套膜和內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞吸收鈣離子并滯留細(xì)胞的含量;另一方面檢測相應(yīng)情況下三角帆蚌α-碳酸酐酶基因(HcCA)表達(dá)量、蛋白表達(dá)量和總碳酸酐酶酶活性。最后對插核120天后不同鈣離子濃度下培養(yǎng)的三角帆蚌取珠分析珍珠表面沉積狀況,旨在探討HcCA的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)量及酶活性探討其與三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量與其HcCA的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)量及酶活性之間的關(guān)系。主要結(jié)果如下:1.HcCA在插核后在內(nèi)臟團(tuán)和外套膜中的基因表達(dá)量分析及Western Blot蛋白分析(1)研究發(fā)現(xiàn),在每一個取樣的時間節(jié)點,0mm與0.5mm濃度處理組的hcca表達(dá)量均處于較低水平,第20天,隨著ca2+濃度上升hcca表達(dá)量也逐步上升(p0.05),50天、90天、120天1.25mm、2mm的hcca表達(dá)量顯著高于其他濃度處理組(p0.05)。當(dāng)ca2+濃度升高到3mm時hcca表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度顯著下降(p0.05)。從每個濃度角度分析發(fā)現(xiàn),50天時的hcca表達(dá)量也顯著高于其他濃度組。所有hcca基因表達(dá)都顯示,外套膜中hcca基因表達(dá)量顯著低于相應(yīng)時期和濃度下的內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量(p0.05)。(2)westernblot實驗結(jié)果驗證了hcca基因在不同濃度不同時期的表達(dá)量2.三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的流式細(xì)胞儀檢測分析(1)本實驗將培養(yǎng)4個月后的三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織加入胰酶37度水浴消化后,加入fluo-4/am溶液37°c孵育30min,pbs溶液、胰酶消化液、孵育液均使用cacl2調(diào)節(jié)溶液鈣離子濃度與培養(yǎng)時水體一致。最后流式細(xì)胞儀中用488mm激發(fā),fli-h熒光通道收集熒光信號,慢速收集104個細(xì)胞。在分析流失數(shù)據(jù)前應(yīng)先根據(jù)細(xì)胞分群設(shè)門以排除細(xì)菌及消化過度的細(xì)胞碎片影響。設(shè)門完成后使用fl1-a對fl1-h作圖,再次設(shè)門以排除未完全消化的非單個細(xì)胞。最后用fl1-h對count作圖統(tǒng)計鈣離子含量。(2)本實驗用平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)外套膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度在0mm到2mm濃度均呈顯著上升趨勢(p0.05),熒光強(qiáng)度在2mm濃度達(dá)到頂峰,而在3mm濃度出現(xiàn)顯著下降(p0.05)。內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞中鈣離子熒光強(qiáng)度隨濃度變化趨勢與外套膜細(xì)胞相同,但整體熒光強(qiáng)度大于外套膜細(xì)胞,且差異顯著(p0.05)。3.三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)和外套膜組織中碳酸酐酶活性在不同環(huán)境鈣離子濃度下差異分析(1)本實驗從培養(yǎng)4個月后不同濃度體系中蚌中取出外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織使用含pmsf的強(qiáng)裂解液提取蛋白隨后在分光光度計中依次加入1.9ml15mmol/ltris-h2s04緩沖液(ph7.6),0.1ml的酶液和1ml3mmol/l的乙酸對硝基苯酯,室溫反應(yīng)5min后在348nm處用分光光度計測定其吸光值,以不加酶液的為空白對照,酶活定義為:在室溫下,每分鐘水解1μmol乙酸對硝基苯醋所需的酶量為一個酶活單位.最后比上測得的樣品蛋白含量,作為單位酶活性。(2)本研究發(fā)現(xiàn)外套膜及內(nèi)臟團(tuán)中的碳酸酐酶活性在環(huán)境鈣離子濃度為0mm-0.5mm時,均顯著高于1.25mm-3mm環(huán)境濃度的活性(p0.05)。并且1.25mm、2mm、3mm環(huán)境濃度濃度的碳酸酐酶活性差異是不顯著的(p0.05)。此外,研究發(fā)現(xiàn)外套膜中的碳酸酐酶活性均顯著高于內(nèi)臟團(tuán)(p0.05),同樣是0.5mm濃度處理組酶活性最高(p0.05),但3mm處理組酶活性高于1.25mm、2mm濃度處理組(p0.05)。4.不同環(huán)境鈣離子濃度養(yǎng)殖下三角帆蚌珍珠質(zhì)沉積的觀察與研究本研究用掃描電鏡分析珍珠表面形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)在外套膜插核育珠180天后,當(dāng)鈣離子濃度為0 mM時,會出現(xiàn)不規(guī)則的碳酸鈣沉積;當(dāng)鈣離子濃度高于0.5 mM,碳酸鈣在珠核上的沉積越來越規(guī)則而緊密;當(dāng)濃度達(dá)到3 mM時,表面變得粗糙,規(guī)則多邊形的沉積結(jié)構(gòu)開始消失。在內(nèi)臟團(tuán)插核育珠180天后的珍珠電鏡結(jié)果顯示,無論是高濃度還是低濃度的鈣離子環(huán)境,碳酸鈣的沉積都非常不規(guī)則,珍珠表面不平整,容易出現(xiàn)裂痕。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)胞外的礦化界面。二者在胞外礦化界面上形成最終礦化產(chǎn)物時均需要有的指導(dǎo)[7]。整個生物礦化過程中有三種重要的調(diào)控保證礦化的有序進(jìn)行，基因調(diào)控、生化調(diào)節(jié)以及生物能量的供給。而且，環(huán)境因素也對礦化過程的影響。所有這些因素共同組成了一個復(fù)雜的相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與生的調(diào)節(jié)(圖 1-2)。具體來說，生物礦化的調(diào)控至少包括空間控制、化學(xué)控制控制、結(jié)構(gòu)控制及構(gòu)造控制等幾種重要的方式[7]。

圖 1-1 生物礦化的一般模型(Mann, 2001)Fig.1-1 General model of biological mineralization(Mann, 2001)

圖 1-3 軟體動物的礦化系統(tǒng)示意圖(戴永定，1994).1-3 Schematic diagram of the mineralization system of mollusc(戴永定，1貝類生物礦化作用的最終產(chǎn)物是貝殼或珍珠，國內(nèi)外學(xué)者對貝殼與珍珠從 18 世紀(jì)初就已經(jīng)開始，第二次世界大戰(zhàn)后，隨著放射性同位素的應(yīng)進(jìn)展更是尤為迅速[9]。由于研究珍珠的形成一般需要進(jìn)行插核等實驗，技術(shù)在 20 實際 60 年代才被推廣開。并且還要求研究者具備臨近大型養(yǎng)

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本文編號：2804386