發(fā)布時間：2020-08-18 12:47

【摘要】：條斑紫菜生長在潮間帶,主要分布于北太平洋西部,是一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻。條斑紫菜產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益高,市場前景廣闊。然而,條斑紫菜產(chǎn)業(yè)目前仍存在周期較長、成本較高、種質(zhì)退化及病害頻發(fā)等問題。解決這些問題的核心為育種,即培育具備優(yōu)良性狀的新品種。本文以條斑紫菜優(yōu)良純系NA為初始藻株,對其自由絲狀體進(jìn)行了化學(xué)誘變,獲得了易于膨大形成殼孢子囊枝的突變株E;分別對突變株E的絲狀體和葉狀體的生理生化特性和組學(xué)進(jìn)行了研究,并實施了育苗和海上試養(yǎng)。主要研究結(jié)果如下:(1)突變株E和初始藻株NA絲狀體的生理生化特性。顯微鏡下兩個藻株絲狀體的形態(tài)無明顯差異。相同溫度下,尤其是18℃,突變株E絲狀體比初始藻株NA更容易形成殼孢子囊枝。在18℃下培育突變株E絲狀體,使其發(fā)育形成殼孢子囊枝,采用低溫縮光誘導(dǎo)的方法能夠促進(jìn)殼孢子放散,放散時間約為9d,在5~7 d時達(dá)到高峰。其中,16℃下放散量較多,日放散量最高可達(dá)(3.15±0.10)×10~7 g~(-1)。用自由絲狀體接種貝殼,突變株E的接種率(21.33%±5.33%)低于初始藻株NA(60.44%±3.08%),說明突變株E絲狀體不容易鉆殼。以殼孢子囊枝比率為參數(shù),研究突變株E營養(yǎng)藻絲的培養(yǎng)條件。結(jié)果顯示其適宜培養(yǎng)條件為16℃,20μmol photons m~(-2)s~(-1)白色光源,25‰~30‰鹽度。(2)突變株E和初始藻株NA絲狀體轉(zhuǎn)錄組的變化。轉(zhuǎn)錄組分析共得到26,949個差異表達(dá)基因,包括11,948個上調(diào)基因和15,001個下調(diào)基因。突變株E絲狀體呼吸作用較強(qiáng),可能是為絲狀體的發(fā)育提供更多能量。第二信使介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)較低,但介導(dǎo)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑較強(qiáng),表明激素可能在突變株E殼孢子囊枝形成過程中發(fā)揮重要作用。編碼細(xì)胞骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和氨基酸合成相關(guān)蛋白等的基因表達(dá)量上調(diào),可能是為突變株E絲狀體發(fā)育(形成殼孢子囊枝)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。(3)突變株E和初始藻株NA葉狀體的生理生化特性。顯微鏡下兩個藻株的幼小葉狀體(≤10 mm)形態(tài)無明顯差異。突變株E幼小葉狀體的生長速率和增量(0.79±0.05 mm d~(-1)和62.50±12.11)大于初始藻株NA(0.26±0.06 mm d~(-1)和8.00±5.15),表明相同條件下,突變株E葉狀體可以釋放更多的單孢子。以光合活性為參數(shù),初步研究了條斑紫菜突變株幼小葉狀體的培養(yǎng)條件,其適宜培養(yǎng)條件為16℃,60~80μmol photons m~(-2)s~(-1)的白色光源,30‰鹽度和碳氮比3:1。將幼小葉狀體(~10 mm)轉(zhuǎn)到10℃培養(yǎng),4 wks后長成較大的葉狀體。兩個藻株的葉狀體均為細(xì)長型,肉眼和顯微鏡下觀察其表面觀和縱面觀無明顯差別。與初始藻株NA相比,突變株E葉狀體具有生長優(yōu)勢。4 wks后,突變株E葉狀體的長度是初始藻株NA的3.5倍,生物量約為NA的3倍。此外,突變株E葉狀體的光合參數(shù)、部分色素(包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白)含量均高于初始藻株NA,而細(xì)胞呼吸速率低于初始藻株NA(p0.05)。葉狀體失水脅迫實驗結(jié)果顯示,在葉狀體細(xì)胞持續(xù)失水過程中,Fv/Fm,Y(I)以及Y(II)均隨之下降。當(dāng)絕對含水量降至9%時,Y(II)的值接近0。復(fù)水15 min后,Y(I)值迅速回升,Fv/Fm和Y(II)也恢復(fù)過半。復(fù)水1 h后,Fv/Fm和Y(I)基本恢復(fù)到原有水平。在此過程中,雖然在某些時間點,突變株E的一些光合參數(shù)值高于初始藻株NA,但整體趨勢無明顯差異。(4)突變株E和初始藻株NA葉狀體轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的變化。轉(zhuǎn)錄組分析共得到1,549個差異表達(dá)基因。其中,上調(diào)基因657個,下調(diào)基因892個。蛋白質(zhì)組分析共鑒定到41個差異蛋白,包括22個上調(diào)蛋白和19個下調(diào)蛋白。整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組結(jié)果,發(fā)現(xiàn)突變株E葉狀體內(nèi)分解代謝前期途徑,如糖酵解、磷酸戊糖途徑以及丙酮酸降解過程增強(qiáng),由此推測前期產(chǎn)物乙酰輔酶A含量較高。呼吸電子傳遞鏈上電子傳遞體減少,且測定結(jié)果顯示細(xì)胞呼吸速率較低,表明突變株E葉狀體呼吸作用較弱。呼吸作用的降低暗示增加的乙酰輔酶A沒有進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)一步分解,而是作為前體參與了脂肪酸的合成。除此之外,突變株E葉狀體內(nèi)一些與光合作用、蛋白合成相關(guān)的基因和蛋白上調(diào),且測定結(jié)果顯示突變株E的光合參數(shù)、色素含量和生物量高于初始藻株NA,這表明突變株內(nèi)的合成代謝如光合作用、蛋白質(zhì)合成等途徑較強(qiáng)。分解代謝較低而合成代謝較高,這可能是突變株E葉狀體生長速率較快的原因。此外,多種抗逆蛋白(如熱激蛋白、抗氧化劑等)表達(dá)量增加,表明條斑紫菜突變株E具有高效抗逆的潛力。(5)在日照華嵐紫菜育苗廠分別接種了突變株E和初始藻株NA的自由絲狀體,接種密度為600段/cm~2。絲狀體生長初期的培養(yǎng)條件為18.5~20℃,最高光強(qiáng)4000 lx,鹽度24.8~26.5‰。之后培養(yǎng)條件為23~26℃,最高光強(qiáng)2500 lx,鹽度24.8~26.5‰。此過程中,絲狀體膨大發(fā)育為殼孢子囊枝,后者成熟后釋放殼孢子。統(tǒng)計殼孢子放散量,發(fā)現(xiàn)突變株E的殼孢子放散總量大于初始藻株NA,日放散量最高可達(dá)240.15±21.83萬個/殼。(6)使用鋪網(wǎng)潑水式采苗,突變株E和初始藻株NA各采兩張網(wǎng),分別掛到威海文登紫菜養(yǎng)殖區(qū)(36°47'54''N 121°58'03''E)和日照嵐山港潮間帶(35°5'24''N 119°18'00''E)進(jìn)行海上試養(yǎng)。威海試養(yǎng)的葉狀體生長狀態(tài)良好,突變株E和初始藻株NA長度、寬度沒有明顯差異,突變株E的Fv/Fm、Y(I)、Y(II)以及大部分光合色素(玉米黃素、葉綠素a、β-胡蘿卜素、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白)含量高于初始藻株NA(p0.05)。而且網(wǎng)繩上試驗苗的密度高于養(yǎng)殖區(qū)其他條斑紫菜,這可能是因為其放散單孢子的能力較強(qiáng)。營養(yǎng)成分分析結(jié)果顯示,條斑紫菜葉狀體中含量較高的為碳水化合物(40.8~41.0 g/100 g DW)和蛋白質(zhì)(36.8~37.1 g/100g DW),其次是灰分(18.3~19.3 g/100 g DW),此外還含有少量的粗纖維(3.5 g/100g DW)和脂肪(1.2~1.6 g/100 g DW)。與初始藻株NA相比,突變株E葉狀體的碳水化合物、蛋白質(zhì)及脂肪含量較高。與三種代表性谷物(小麥、稻米和黃豆)營養(yǎng)成分相比,條斑紫菜為高蛋白質(zhì)低脂肪的綠色健康食品。氨基酸組成分析結(jié)果共測得18種氨基酸的含量,包括8種必需氨基酸和10種非必需氨基酸。其中,甲硫氨酸和胱氨酸為試養(yǎng)的條斑紫菜葉狀體中的限制性氨基酸。除甲硫氨酸和異亮氨酸外,條斑紫菜突變株E葉狀體內(nèi)其他氨基酸(包括9種呈味氨基酸)的含量均高于初始藻株NA。呈味氨基酸中甜味類和鮮味類氨基酸總量在所測氨基酸總量中超過50%。脂肪酸分析共檢測到14種脂肪酸,包括3種飽和脂肪酸、6種單不飽和脂肪酸和5種多不飽和脂肪酸。突變株E葉狀體中總脂肪酸含量和單項脂肪酸的含量均高于初始藻株NA。日照試養(yǎng)的突變株E葉狀體的密度、長度、光合活性以及色素含量均大于初始藻株NA(p0.05)。水質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn),日照養(yǎng)殖區(qū)缺氮缺磷,威海養(yǎng)殖區(qū)缺氮。在同樣缺氮的情況下,兩個養(yǎng)殖區(qū)試養(yǎng)的條斑紫菜生長情況具有明顯差異,可能受不同環(huán)境和養(yǎng)殖方式的影響。日照養(yǎng)殖區(qū)海上試養(yǎng)后期,初始藻株NA和養(yǎng)殖區(qū)其他條斑紫菜出現(xiàn)腐爛脫網(wǎng)等現(xiàn)象,而突變株E葉狀體生長狀態(tài)較好,顏色較深,韌性較強(qiáng)。這表明在營養(yǎng)缺乏條件下,條斑紫菜突變株E葉狀體的適應(yīng)能力更強(qiáng)。本研究通過自由絲狀體的化學(xué)誘變獲得了條斑紫菜突變株E,其絲狀體易于膨大形成殼孢子囊枝,葉狀體生長速率高于初始藻株NA。分析突變株E和初始藻株NA絲狀體及葉狀體組學(xué)的變化,發(fā)現(xiàn)突變株E絲狀體內(nèi)第二信使介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)較低,但介導(dǎo)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑較強(qiáng),表明激素可能在條斑紫菜突變株絲狀體形成殼孢子囊枝方面發(fā)揮重要作用;突變株E葉狀體合成代謝較強(qiáng),分解代謝較弱,這可能是其葉狀體生長速率較快的原因。研究中的組學(xué)數(shù)據(jù)為條斑紫菜分子育種提供了理論基礎(chǔ)。同時,本研究還進(jìn)行了條斑紫菜突變株E的育苗及海上試養(yǎng),為今后的人工栽培積累了實踐經(jīng)驗。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.3
【圖文】：

圖 1.1 紫菜生活史(王旭雷 等，2017)Figure 1.1 The life history of Pyropia/Porphyra條斑紫菜的營養(yǎng)價值及人工栽培 條斑紫菜的營養(yǎng)價值條斑紫菜味道鮮美，營養(yǎng)價值高，是天然的海洋珍品。紫菜是高蛋白，蛋白質(zhì)含量最高可達(dá) 50%，且富含多種人體必需的氨基酸，而脂肪含～3%。此外，條斑紫菜還含有多種膳食纖維、維生素（維生素 A，B 物質(zhì)元素（鎂、鈣、鐵、鋅、碘等）（Rao etal.,2007; 張全斌 等,200此，條斑紫菜體內(nèi)的活性物質(zhì)還具備保健功效和藥用價值。研究表明中的�；撬釋雰旱纳L發(fā)育，尤其是大腦發(fā)育具有促進(jìn)作用（王芬

圖 2.1 條斑紫菜單藻絲Figure 2.1 A filament of Py. yezoensis討論的條斑紫菜絲狀體細(xì)胞致死率變劑量試驗結(jié)果顯示，雖然對照組的無水乙醇對條斑的損傷，但與 EMS 相比，這種損傷較小，可以不予考，除了 0.1 M EMS 的四個處理和 0.2 M EMS 30 min的細(xì)胞死亡率均超過 50%。表 2.2 顯示，2wks 后，除外，其余處理條件下的細(xì)胞死亡率均超過 50%。如果0.1 M EMS 的 4 個處理和 0.2 M EMS 30 min 處理之外。在此基礎(chǔ)上，比較兩表中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) 5 組處理條

圖 2.2 條斑紫菜誘變絲狀體的生長情況誘變條件下的絲狀體；b, 0.2 M EMS 60min 處理的 E、F3 和 C6 絲狀Figure 2.2 The growth of mutagenic conchocelis of Py. yezoensishocelis under other mutagenic conditions; b, conchocelis of E, F3 and C6EMS 60min

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