【摘要】：潮間帶區(qū)域環(huán)境復(fù)雜多變,長牡蠣作為典型潮間帶生物,終生營固著方式生存于潮間帶區(qū)域,進化形成了較強的抗病原侵染、抗干露脅迫等抗環(huán)境脅迫機制。miRNA作為重要的表觀調(diào)控手段,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),參與免疫應(yīng)答等生理過程。然而目前對miRNA的研究主要集中于高等動物或其他模式生物中,在無脊椎非模式生物中的研究還處于起步階段。本研究以長牡蠣為材料,通過分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)與生物信息學(xué)的手段,鑒定了長牡蠣血淋巴細(xì)胞miRNA,并概述了其在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的作用;基于長牡蠣免疫過程,篩查了關(guān)鍵代表性miRNA,并解析了其在病原脅迫下介導(dǎo)的免疫應(yīng)答調(diào)控機制;通過多組學(xué)整合分析,篩選了干露脅迫相關(guān)mi RNA,探究了其介導(dǎo)的干露適應(yīng)調(diào)節(jié)機制。通過二代測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析,對長牡蠣mi RNA進行了全基因組范圍的篩查及鑒定,在長牡蠣中發(fā)現(xiàn)了331條miRNA,其中76條為保守miRNA,255條為全新miRNA,長牡蠣中鑒定出的miRNA數(shù)量為已知貝類中最多。有38條長牡蠣miRNA同時被發(fā)現(xiàn)響應(yīng)免疫調(diào)質(zhì)乙酰膽堿ACh或去甲腎上腺素NE刺激,并能夠靶定355個長牡蠣基因,其中包括免疫識別受體,免疫通路信號分子,免疫效應(yīng)分子及神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)分子等。從長牡蠣中鑒定出保守miRNA cgi-miR-92d,其表達(dá)水平在免疫應(yīng)答早期顯著下調(diào),在免疫應(yīng)答后期迅速升高。CgLITAF3作為長牡蠣LITAF同源基因及cgi-miR-92d的靶基因,其表達(dá)水平在免疫應(yīng)答早期迅速上升,在免疫應(yīng)答后期顯著下降。體外雙熒光實驗結(jié)果表明,cgi-miR-92d能夠通過結(jié)合CgLITAF3編碼區(qū)抑制其表達(dá)。體外過表達(dá)實驗表明,CgLITAF3能誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞中HsTNF-α表達(dá),且誘導(dǎo)效果受cgi-miR-92d抑制。CgTNF作為長牡蠣TNF-α同源基因,其表達(dá)水平在免疫應(yīng)答早期顯著升高,而在免疫應(yīng)答后期顯著下降,且趨勢晚于CgLITAF3。研究發(fā)現(xiàn),病原刺激后,敲減長牡蠣體內(nèi)cgi-miR-92d能夠顯著降低CgLITAF3及CgTNF表達(dá)水平。scaffold42648_5080是長牡蠣特有miRNA,編碼于長牡蠣基因內(nèi)含子區(qū)域。scaffold42648_5080能響應(yīng)LPS刺激且在免疫應(yīng)答早期顯著下調(diào)。同時能夠靶定包括CgILK在內(nèi)的31個長牡蠣基因,參與細(xì)胞通訊、定位、應(yīng)激反應(yīng)等調(diào)控過程。其中,CgILK作為長牡蠣integrin通路中核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,同樣能響應(yīng)LPS刺激且顯著上調(diào)。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,scaffold42648_5080能夠在體外結(jié)合CgILK 3’-UTR,并抑制其表達(dá)。在免疫應(yīng)答過程中,長牡蠣血細(xì)胞遷移能力隨CgILK表達(dá)量的升高或降低而發(fā)生相應(yīng)變化,在體內(nèi)敲減scaffold42648_5080后,CgILK表達(dá)水平顯著升高,長牡蠣血淋巴細(xì)胞遷移能力顯著升高。免疫細(xì)胞吞噬作用是機體清除外來病原的重要機制,受NF-κB等通路調(diào)控。燦爛弧菌刺激后長牡蠣血淋巴細(xì)胞吞噬能力顯著升高而NF-κB通路中核心抑制因子CgIκB2表達(dá)水平顯著降低。體內(nèi)敲減CgIκB2基因后,長牡蠣血淋巴細(xì)胞吞噬能力顯著升高。長牡蠣能夠編碼一個無脊椎動物特有的mi RNA cgi-miR-2d。燦爛弧菌刺激后,其表達(dá)水平迅速升高,趨勢與CgIκB2基因相反。生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,cgi-miR-2d能夠結(jié)合CgIκB2 3’-UTR并抑制其表達(dá)。同時,在長牡蠣體內(nèi)過表達(dá)cgi-miR-2d后,CgIκB2基因表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞吞噬能力顯著升高;在長牡蠣體內(nèi)敲減cgi-miR-2d后,CgIκB2基因表達(dá)水平略有升高,細(xì)胞吞噬能力迅速降低。乙酰膽堿ACh是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)遞質(zhì),也是重要的免疫調(diào)質(zhì)。貝類具有原始的膽堿能神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng),并能參與調(diào)控其免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),燦爛弧菌刺激12小時后,長牡蠣血淋巴細(xì)胞中ACh顯著升高,同時長牡蠣膽堿轉(zhuǎn)運體同源基因CgCTL1表達(dá)量在免疫應(yīng)答前期降低,在免疫應(yīng)答后期恢復(fù)正常。敲減CgCTL1后,長牡蠣血淋巴細(xì)胞內(nèi)膽堿及細(xì)胞外ACh含量顯著降低,CgTNFs表達(dá)水平顯著升高。生物信息學(xué)分析及雙熒光實驗表明,cgi-miR-2d能夠結(jié)合CgCTL1 3’-UTR并抑制其表達(dá)。體內(nèi)過表達(dá)cgi-mi R-2d后CgCTL1表達(dá)水平顯著降低,血淋巴細(xì)胞內(nèi)膽堿轉(zhuǎn)運與ACh合成釋放迅速下降,CgTNFs表達(dá)水平升高;體內(nèi)敲減cgi-mi R-2d后,CgCTL1表達(dá)水平顯著升高,血淋巴細(xì)胞內(nèi)膽堿含量顯著增加,細(xì)胞外ACh含量及CgTNFs表達(dá)水平保持不變,細(xì)胞抗菌能力顯著降低。去甲腎上腺素NE是高等動物兒茶酚胺能系統(tǒng)中主要的神經(jīng)遞質(zhì),也是重要的應(yīng)激激素。長牡蠣具有原始的兒茶酚胺能系統(tǒng),并在干露脅迫后迅速激活。干露脅迫后cgi-miR-365表達(dá)水平顯著升高,且在NE受體封閉后降低表達(dá)。靶基因分析表明,cgi-miR-365能夠靶定CgHSP90AA1在內(nèi)15個長牡蠣基因,參與調(diào)控物質(zhì)代謝及脅迫應(yīng)激等生理過程。其中,CgHSP90AA1能響應(yīng)NE刺激并在干露脅迫后表達(dá)升高。雙熒光實驗表明,cgi-mi R-365能夠結(jié)合CgHSP90AA13’-UTR并促進其表達(dá)。在長牡蠣原代細(xì)胞中過表達(dá)cgi-miR-365后,CgHSP90AA1表達(dá)水平顯著升高。在干露脅迫的長牡蠣中敲減cgi-miR-365后,CgHSP90AA1表達(dá)水平則顯著降低。長牡蠣鈣調(diào)蛋白CgCaM是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子結(jié)合蛋白,能夠激活一氧化氮合酶NOS,促進NO合成釋放。NO是細(xì)胞內(nèi)重要的炎癥調(diào)控因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)。干露脅迫后,長牡蠣血淋巴中CgCaM與細(xì)胞因子CgTNF等表達(dá)水平、NOS活性、NO含量呈現(xiàn)相似的先降低后升高的趨勢,而鈣離子濃度持續(xù)升高。對CgCa M進行抑制劑注射或體內(nèi)敲減后,發(fā)現(xiàn)NOS酶活、NO含量、CgTNF等細(xì)胞因子表達(dá)水平均顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)scaffold631_909、cgi-miR-7、scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c、cgi-mi R-92e、cgi-miR-92f、scaffold1600_212等8個長牡蠣mi RNA能夠調(diào)控CgCaM。與此同時,scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c及scaffold1600_212等6個miRNA在干露后迅速上調(diào)表達(dá),后期表達(dá)回落。雙熒光實驗表明,以上miRNA能夠在體外結(jié)合CgCaM 3’-UTR并抑制其表達(dá)。同時,干露脅迫后,在長牡蠣體內(nèi)過表達(dá)單一miRNA,CgCaM表達(dá)水平顯著降低,NOS酶活、NO含量、CgTNF表達(dá)水平顯著降低;而敲減單一miRNA,CgCaM表達(dá)水平、NOS酶活、NO含量、CgTNF表達(dá)水平則無顯著變化。干露脅迫中同時敲減scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c及scaffold1600_212,CgCaM表達(dá)水平、NOS酶活、NO含量、CgTNF表達(dá)水平則顯著升高。干露脅迫中持續(xù)注射CgCaM或NOS的抑制劑CDZ或L-NMMA后,長牡蠣肝胰腺損傷情況顯著好轉(zhuǎn)。本研究的結(jié)果表明,長牡蠣具有復(fù)雜的mi RNA介導(dǎo)的環(huán)境脅迫應(yīng)答調(diào)控機制,能夠通過靶定免疫識別受體,免疫通路信號分子,免疫效應(yīng)分子及神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)分子等系統(tǒng)地調(diào)控機體免疫應(yīng)答反應(yīng)及干露脅迫應(yīng)答反應(yīng),miRNA調(diào)控機制對于長牡蠣適應(yīng)潮間帶環(huán)境具有重要生理意義。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

2圖 1.1 動物 miRNA 轉(zhuǎn)錄及調(diào)控機制模型(He and Hannon, 2004)Fig 1.1 the Biogenesis and Function of Animal miRNA實際研究中對 miRNA 的界定通常還需要參考以下幾個標(biāo)準(zhǔn) (Kim, 2005)。首先是 miRNA 的表達(dá)水平， 般情況下 miRNA 的存在需要經(jīng)過 Northern blot 驗證，或者經(jīng)過 RT-PCR、miRNA 芯片，二代測序等證實。尤其是 Northern blot實驗被認(rèn)為是驗證 miRNA 成熟體或前體序列的經(jīng)典方法；隨著大規(guī)模測序技術(shù)成本的降低，基于高通量測序技術(shù)的方法逐漸成為鑒定 miRNA 的主流方案。其

miRNA 在長牡蠣環(huán)境脅迫應(yīng)答中的調(diào)控作用的突出 (Gwizdek et al., 2003; Zeng and Cullen, 2004)。轉(zhuǎn)運至細(xì)胞iRNA 將會在 RNA 酶 III Dicer 的催化下進 步剪切，脫去環(huán)狀結(jié)構(gòu)，NA 雙鏈復(fù)合體（miRNA duplexes） (Hutvágner et al., 2001; Knight and)。miRNA 雙鏈復(fù)合體極不穩(wěn)定，在果蠅中能夠受到 Dicer-R2D2 催化鏈選擇（strand selection）形成成熟的 miRNA 序列 (Liu et al., 2003)。NA 成熟過程中重要的 RNA 酶，Dicer 廣泛存在于幾乎所有真核生物中同物種中可能具有多個同源基因，并行使不同的功能 (de Jong et al., herjee et al., 2013)。如，果蠅中存在 Dicer-1 與 Dicer-2 兩個基因，前者 pre-miRNA 剪切，后者主要參與 siRNA 形成 (Lee et al., 2004b)。

圖 1.3 miRNA 剪切成熟相關(guān)基因結(jié)構(gòu)示例(Kim, 2005)Fig.1.3 genes involved in miRNA biogenesis植物 miRNA 的產(chǎn)生機制與動物相比略有不同 (Chen, 2005)。首先，植物中不存在 Drosha 與 DGCR8/Pasha 基因。其次，植物中 pri-miRNA 長度長于動物pri-miRNA，而 pre-miRNA 尚未被大量鑒定，因此結(jié)構(gòu)尚不明確 (Reinhart et al.,2002)。有報道認(rèn)為，植物中存在 個 Dicer 酶同源基因 DCL1，具有類似 Drosha及 Dicer 的功能，即在細(xì)胞核內(nèi)通過剪切 pri-miRNA 形成 miRNA 雙鏈復(fù)合體(Reinhart et al., 2002)。形成的 miRNA 雙鏈復(fù)合體再經(jīng)過 Exportin-5 同源基因HASTY 轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中 (Bollman et al., 2003; Park et al., 2005)。細(xì)胞質(zhì)中的miRNA 雙鏈復(fù)合體最終在解旋酶的催化下，形成 miRNA 成熟體（圖 1.4）。隨著高通量測序技術(shù)在 miRNA 研究中的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)不同物種間既

本文編號：2794411