【摘要】：斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟物種。近年來,養(yǎng)殖環(huán)境污染引起的對蝦病原菌感染病害問題日益嚴重,制約了斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展�；【且活惼毡榉植加诤车暮涌诤脱睾Ｋ蛑械母锾m氏陰性病原菌,其中副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)能引起對蝦“紅腿病”和“爛鰓病”等病癥,還是導(dǎo)致“急性肝胰腺壞死綜合癥”,又稱“早期死亡綜合癥”(early mortality syndrome,EMS)暴發(fā),造成對蝦大量死亡的主要原因。對蝦的先天性免疫是維持蝦健康的重要屏障,因此,深入的研究斑節(jié)對蝦的先天性免疫防御,對于控制對蝦疾病,健康發(fā)展對蝦養(yǎng)殖具有重要的意義。抗菌肽(Antimicrobialpeptides,AMP)是指生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì),存在于所有真核生物中是先天免疫系統(tǒng)中,是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。甲殼類動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽主要包括抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)、甲殼肽(Crustin)和對蝦素(Penaeidin)等。Akirin是一類由180~204個氨基酸酸殘基組成的高度保守的核蛋白,在先天性免疫調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。Akirin廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中。研究發(fā)現(xiàn)該基因在果蠅天然免疫通路中具有重要的作用。當(dāng)其被沉默表達之后,果蠅抗菌肽Attacin的表達量降低了90%。與此同時,果蠅明顯容易受到革蘭氏陰性細菌感染。本研究成功克隆了斑節(jié)對蝦Akirin基因(命名為PmAkirin),并初步探究了它的免疫功能。PmAkirin cDNA序列全長1508bp,其中包括編碼213個氨基酸的ORF 642bp、一個50bp的5’-UTR和一個816bp的3’-UTR。通過ExPASy軟件預(yù)測PmAkirin的蛋白分子量為23.82 KDa,理論等電點為9.05。根據(jù)已有的文獻分析,PmAkirin包含兩個核定位信號,分別是26~30位(KRRRC)和78~81位(KRRK)。這和多數(shù)哺乳動物的Akirin2序列相一致。另外PmAkirin還包含一個抗菌結(jié)構(gòu)域,DEFSN結(jié)構(gòu)域(3~34位)。通過多重序列比對分析,表明Akirin具有較高的保守性,其中N端和C端的保守性相對較強,進化上我們通過對不同物種的Akirin蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),Akirin被分為脊椎動物和無脊椎動物兩大類,其中脊椎動物又分為Akirin1和Akirin2兩小類。PmAkirin是其中無脊椎動物一類的,與凡納濱對蝦(南美白對蝦)和日本囊對蝦的進化關(guān)系最近,與脊椎動物的Akirin2進化關(guān)系較近。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),PmAkirin在鰓、肝胰腺、胃、心臟、腸、肌肉和血淋巴等七個組織中均有表達。其中PmAkirin在血淋巴中表達量最高,其次是在心臟、鰓、胃和肝胰腺,在腸和肌肉中表達量較低。為了探究PmAkirin對抗菌肽表達調(diào)控及其在斑節(jié)對蝦先天性免疫中的重要作用,我們對其進行了dsRNA-Akirin和mRNA-Akirin的干擾實驗和過表達實驗。通過原位雜交實驗和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),dsRNA-Akirin和mRNA-Akirin的干擾和過表達實驗,成功的特異性干擾和過表達了PmAkirin。在副溶血性弧菌感染斑節(jié)對蝦之后,肝胰腺組織中的PmAkirin mRNA表達水平顯著性上調(diào)。與感染前相比,感染后12h時,mRNA-Akirin、dsRNA-Akirin、dsRNA-GFP、PBS和空白對照五組分別為感染前的1.67、1.74、1.75、1.5和1.74倍。說明PmAkirin在免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。通過dsRNA-Akirin的干擾實驗,特異性干擾PmAkirin mRNA 24h后,再注射副溶血性弧菌,與菌感染組相比,抗脂多糖因子(ALF)PmALF2、PmALF3和PmALF6等抗菌肽基因mRNA的表達水平分別為0.5、0.39和0.42倍,甲殼肽(Crustin)PmCrus1和PmCrus4等抗菌肽基因mRNA的表達水平分別為0.39和0.35倍,對蝦抗菌素(Penaeidin)PmPEN3a、PmPEN3b和PmPEN5等抗菌肽基因mRNA表達水平分別為0.44、0.45和0.46倍。通過mRNA-Akirin的過表達實驗,特異性過表達PmAkirin mRNA 24h后,再注射副溶血性弧菌,與菌感染組相比,抗脂多糖因子(ALF)PmALF2、PmALF3和PmALF6等抗菌肽基因mRNA的表達水平分別為1.7、1.74和2.61倍,甲殼肽(Crustin)PmCrus1和PmCrus4等抗菌肽基因mRNA的表達水平分別為1.97和1.58倍,對蝦抗菌素(Penaeidin)PmPEN3a、PmPEN3b和PmPEN5等抗菌肽基因mRNA表達水平分別為1.86、1.79和2.07倍。這表明PmAkirin可能參與了抗菌肽基因的表達調(diào)控。通過dsRNA-Akirin和mRNA-Akirin的干擾和過表達實驗,特異性干擾和過表達PmAkirin mRNA后,再通過肌肉注射副溶血性弧菌感染斑節(jié)對蝦,發(fā)現(xiàn)(dsRNA-Akirin+菌)組,蝦的血淋巴中副溶血性弧菌的濃度顯著高于菌感染組、(dsRNA-GFP+菌)組和(PBS+菌)組,大約是菌感染組的1.87倍,而存活個數(shù)遠則低于菌感染組、(dsRNA-GFP+菌)組和(PBS+菌)組;(mRNA-Akirin+菌)組,蝦的血淋巴中副溶血性弧菌的濃度顯著低于菌感染組、(dsRNA-GFP+菌)組和(PBS+菌)組,大約是菌感染組的0.41倍,存活個數(shù)遠高于菌感染組、(dsRNA-GFP+菌)組和(PBS+菌)組,我們推測PmAkirin通過對抗菌肽的表達調(diào)控,參與了對斑節(jié)對蝦血淋巴中副溶血性弧菌的清除過程,從而影響了病原菌感染后對蝦的存活率。本文對斑節(jié)對蝦的Akirin基因進行了免疫功能研究。證明了PmAkirin可以對下游抗菌肽的表達進行調(diào)控。PmAkirin具有的一個DEFSN抗菌結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果表明PmAkirin在斑節(jié)對蝦的先天性免疫中具有重要的作用。這為深入研究對蝦的先天性免疫機理以及促進對蝦健康養(yǎng)殖工作提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

第一章 引 言1.1 斑節(jié)對蝦簡介斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)，又被稱為黑虎蝦(Black tiger shrimp)和草蝦shrimp)(圖 1-1)，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda) 、甲殼綱(Crustacea)、十(Decapoda)、對蝦科(Penaeidae)、對蝦屬(Penaeus)。斑節(jié)對蝦的個體大，產(chǎn)量生長迅速、肉質(zhì)鮮美和食性廣泛，是當(dāng)前世界三大養(yǎng)殖蝦類之一[1]。斑節(jié)對蝦屬中體型最大的種，發(fā)現(xiàn)的最大體長為 33cm，體重超 500g。成熟的斑節(jié)常體長能夠達到 22.5～32 厘米，體重 137～211 克。斑節(jié)對蝦廣泛分布于印及太平洋區(qū)域[2]。這些年，在墨西哥灣的北部以及美國南部的大西洋區(qū)域也分布[2]。自上個世紀的 80 年代開始，斑節(jié)對蝦的養(yǎng)殖規(guī)模日益增大。在我節(jié)對蝦的養(yǎng)殖多分布在南方沿海地區(qū)，是一種重要水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟種類之一[3]

圖 1-2.革蘭氏陰性菌菌膜[58]Fig. 1-2 Gram-negative bacteria cell membrane[58]甲殼肽通過兩性分子的模式插入病原菌細胞膜，進而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，達到抗菌的目的；抗脂多糖因子是可以與脂多糖結(jié)合的多肽分子，通過結(jié)合細菌的類脂 A，從而破壞病原菌細胞壁上內(nèi)毒素的毒性，起到抗菌作用；對蝦抗菌素是一種陽離子抗菌肽，通過破壞細菌細胞膜，使其細胞質(zhì)外流，細菌裂解死亡，產(chǎn)生抗真菌和細菌效應(yīng)[59]。Destoumieux 等在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的血細胞和血漿中提取出了幾種抗菌肽,并檢測了 3 種抗菌肽的氨基酸序列,初次發(fā)表了甲殼動物的抗菌肽氨基酸的完整序列[60]。在 2004 年 Cuthbertson 等人，在凡納濱對蝦的血細胞 cDNA 文庫中發(fā)現(xiàn)了一種新的對蝦抗菌素，序列不同于以往發(fā)現(xiàn)的對蝦抗菌素，可以有效殺死尖孢鐮刀菌[61]。2011 年高煥等人[62]發(fā)現(xiàn)，在中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis) 感染了對蝦白斑綜合病毒(WSSV)后，它的肝胰腺、鰓、肌肉和腸等組織出現(xiàn)了抗菌肽的顯著變化。Shanthi 等人從印度白對蝦

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文納濱對蝦的先天免疫中存在作用[66]。而 Akirin 通過革蘭氏陰性菌感染后其表達平顯著上升，而通過革蘭氏陽性菌感染后 Akirin 表達水平無顯著改變[83]。在日囊對蝦中，也呈現(xiàn)這種情況，當(dāng)蝦受到鰻弧菌(V. anguillarum)感染后，Akirin 表水平顯著性上調(diào)，而用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染后，和對照組比 Akirin 表達水平無顯著性變化，說明 Akirin 只對革蘭氏陰性菌具有作用，而革蘭氏陽性菌沒有免疫防御[28]。

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本文編號：2793488