【摘要】：Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor,Runx)是一個轉(zhuǎn)錄因子家族。哺乳動物Runx家族包含3個成員:Runxl、Runx2和Runx3,它們在多種生理活動中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。其中Runx1和Runx3在免疫系統(tǒng)中的功能更令人關(guān)注,主要參與調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖、分化和功能等。目前,雖然斑馬魚和河渶的Runx家族成員及其輔助因子CBFβ已被克隆和鑒定,但是Runx1和Runx3在魚類的免疫學(xué)功能還未知。本論文以草魚為研究模型,首先鑒定了Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征,然后提供它們參與免疫反應(yīng)的證據(jù),最后闡明它們的免疫調(diào)節(jié)功能,特別是在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)調(diào)節(jié)作用中的地位。研究內(nèi)容如下:1.草魚Runx1和Runx3的分離鑒定和誘導(dǎo)表達分析:(1)通過簡并PCR和RACE PCR等多次PCR反應(yīng),克隆獲得草魚Runx1五種剪接體(Runx1 v1-5)和Runx3的cDNA序列。結(jié)構(gòu)特征分析、氨基酸多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析證明它們分別是哺乳動物的Runx1和Runx3的同源基因。(2)Runx1的五種剪接體中,Runx1 v1-3具有完整的功能結(jié)構(gòu)域,包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(transactivation domain,TAD)、抑制結(jié)構(gòu)域(inhibitory domain,ID)、PY模體及C末端VWRPY模體,而Runx1 v4-5缺乏TAD、ID、PY及VWRPY等功能結(jié)構(gòu)域。組織分布檢測發(fā)現(xiàn)Runx1v1-3和Runx1 v4-5具有相似的組織分布特征,在胸腺中表達水平最高,其次是脾、腎、頭腎等組織,在外周血白細胞中表達較高;Runx3在胸腺和脾中表達水平最高,其次是外周血白細胞。(3)LPS和PHA均能刺激草魚外周血白細胞Runx1 v1-3、Runx1 v4-5和Runx3基因表達上調(diào),而poly I:C只對Runx1 v1-3和Runx3有誘導(dǎo)作用。(4)嗜水氣單胞桿菌感染促使草魚Runx1 v1-3和Runx3在頭腎、脾及胸腺組織中的表達不同程度增強,而Runx1 v4-5的表達上調(diào)僅發(fā)生在脾和胸腺組織。Runx1 v1-3和Runx1 v4-5在體內(nèi)外免疫刺激實驗中呈現(xiàn)出不同的時間動力學(xué)特征,說明它們的免疫功能可能存在差異;推測Runx1 v4-5可能作為一種天然存在的抑制劑,調(diào)控硬骨魚Runx1信號通路中過度的激活反應(yīng)。2.草魚Runx輔助因子CBFβ的分離鑒定和表達特征:(1)通過多種PCR技術(shù),分離獲得草魚CBFβ的cDNA序列;氨基酸多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析證明它是哺乳動物CBFβ的同源基因。(2)3D同源建模表明草魚CBFβ的空間結(jié)構(gòu)與哺乳動物CBFβ的空間結(jié)構(gòu)相似度極高;CBFβ在結(jié)構(gòu)上的高度保守性暗示了其在進化過程中的功能保守性。(3)CBFβ和Runx1、Runx3具有相似的組織分布特征,在胸腺中表達水平最高,其次是脾、頭腎,在外周血白細胞中表達較高。(4)cbfβ主要定位于細胞核,證明了其作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的基本特性。(5)lps、pha和polyi:c均能刺激草魚外周血白細胞cbfβ基因表達上調(diào)。(6)嗜水氣單胞桿菌感染草魚后,cbfβ基因在頭腎、脾和胸腺組織中表達水平上調(diào),進一步確證cbfβ參與了硬骨魚免疫反應(yīng)。3.草魚runx1和runx3的功能鑒定:(1)runx1五種剪接體和runx3無需刺激,即能夠直接入核,證明它們作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的基本特性。(2)進一步探討草魚runx1和runx3對t細胞亞型的標志細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達的影響。采用runx1抑制劑的研究發(fā)現(xiàn):草魚外周血白細胞中l(wèi)ps、pha和polyi:c誘導(dǎo)草魚細胞因子ifn-?、il-17a/f1和il-17a/f2基因的表達,這些刺激作用被阻斷runx1信號所抑制。但阻斷runx1信號并不影響polyi:c對轉(zhuǎn)錄因子foxp3表達的上調(diào)。(3)由于沒有特異的runx3抑制劑,采用過表達草魚runx3方法的結(jié)果顯示:在草魚腎細胞系(grasscarpkindneycelllines,cik)中,過表達草魚runx3上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子t-bet的表達,而抑制轉(zhuǎn)錄因子gata3的表達,但過表達runx3或/和cbfβ對foxp3的基因表達水平無影響。(4)研究草魚runx1、runx3和輔助因子cbfβ的相互作用關(guān)系,結(jié)果顯示:草魚runx1和runx3之間并無相互作用關(guān)系,但過表達runx1的兩種代表性剪接體和runx3均顯著誘導(dǎo)cbfβ基因的表達,提示cbfβ可能參與runx1和runx3的調(diào)節(jié)作用。但是過表達的cbfβ并沒有協(xié)同runx3的作用,可能因為內(nèi)源性的cbfβ足以滿足runx3發(fā)揮功能,或者runx3-cbfβ的協(xié)同作用還需要其它轉(zhuǎn)錄因子的參與。4.草魚tgf-β免疫調(diào)節(jié)作用中runx1和runx3的表達和功能研究:(1)在草魚外周血白細胞中,重組的草魚tgf-β1上調(diào)草魚cbfβ基因的表達,而對runx1v1-3和runx1v4-5基因的表達存在先上調(diào)再下調(diào)的雙重調(diào)節(jié)作用,提示它們在tgf-β的免疫調(diào)節(jié)作用中不同的誘導(dǎo)表達特征。(2)特別地,與誘導(dǎo)cbfβ和runx1表達比較,tgf-β1更顯著提高runx3的mrna水平。為強化該結(jié)果,本研究還檢測了草魚tgf-β1對runx3蛋白表達的影響,為此首先制備和鑒定草魚runx3多克隆抗體。wb分析顯示runx3多克隆抗體能識別分子量約為49kda的runx3重組蛋白和外周血白細胞中的內(nèi)源性runx3蛋白(分子量約為46kda),證明了該抗體的有效性。采用該抗體的wb的結(jié)果顯示tgf-β1刺激runx3的蛋白高表達,說明runx3可能是runx家族中tgf-β1作用的主要成員。(3)為檢驗runx1和runx3參與tgf-β調(diào)節(jié)作用的假設(shè),在外周血白細胞中研究在tgf-β1抑制c-myc表達過程中runx1和runx3的功能。具體地,抑制runx1信號放大了tgf-β1對c-myc的抑制作用,提示runx1可能是tgf-β1調(diào)節(jié)c-myc表達的負調(diào)控因素。相反地,過表達Runx3反而放大TGF-β1對c-Myc表達的抑制作用,提示Runx3可能促進了TGF-β1的該調(diào)節(jié)作用。為明確Runx3的上述功能,進一步構(gòu)建Runx3顯性失活質(zhì)粒,在CIK中過表達該質(zhì)粒后c-Myc的表達明顯上調(diào),但TGF-β1能夠抑制該刺激作用。結(jié)合上述(2)的結(jié)果,即TGF-β1明顯刺激Runx3的產(chǎn)生,這些結(jié)果提示TGF-β1可能通過誘導(dǎo)Runx3的產(chǎn)生來抑制c-Myc的表達。但Runx1和Runx3在TGF-β1調(diào)節(jié)c-Myc表達中發(fā)揮不同功能的機制有待研究。(4)進一步,在外周血白細胞中研究在TGF-β1調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)新分子nIL-1F表達過程中Runx1和Runx3的功能。結(jié)果顯示TGF-β1抑制nIL-1F的表達,但Runx1和Runx3均沒有參與TGF-β1的該抑制作用,提示Runx1和Runx3并沒有參與TGF-β1的所有調(diào)節(jié)活動。總之,本論文在闡明草魚Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征基礎(chǔ)上,提供它們參與了魚類免疫反應(yīng)的證據(jù),首次詮釋了魚類Runx1和Runx3的免疫調(diào)節(jié)功能,特別揭示了它們在TGF-β1免疫調(diào)節(jié)作用中的地位,從而增加了基于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的魚類免疫學(xué)知識。
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié) T 細胞的譜系選擇[4]2 轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)外周初始 CD4+T 細胞分化成 Th 細胞和 Treg 細胞在調(diào)控T細胞的發(fā)育和分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位參與調(diào)控B細胞的發(fā)育和分化，且與B細胞的功能密切相關(guān)[43]。

3 1-2 轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)外周初始 CD4+T 細胞分化成 Th 細胞和 Treg 細胞亞群了在調(diào)控T細胞的發(fā)育和分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位，R 還參與調(diào)控B細胞的發(fā)育和分化，且與B細胞的功能密切相關(guān)[43]。RunB細胞發(fā)育的各個階段[44-46]，采用誘導(dǎo)滅活的方法使Runxl或CBFβ不小鼠遭遇B細胞發(fā)育障礙且分化停滯[47, 48]，而敲除定向造血干細則導(dǎo)致前B細胞和成熟B細胞數(shù)量的減少[49]。Runx3 也在B細胞系中在免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換成IgA過程中發(fā)揮了重要作用[51]。此外，R樹突狀細胞中特異地表達，敲除Runx3 的小鼠的樹突狀細胞激活CD且β2-整合素表達異常[51]。

及氨基酸序列的分析通過簡并PCR和RACE PCR等多次PCR, 克隆獲得草魚Runx1 五種剪接體cDNA (GenBank ID: KF411035 KF411039) 。其中Runx1 v1 的cDNA序列最長(圖3-1)，包含 222 bp的 5′UTR，1383 bp的CDS和 213 bp的 3′UTR。圖 3-1 草魚 Runx1 v1 的 cDNA 及氨基酸序列注：cDNA 序列用小寫字母表示；氨基酸序列用大寫字母表示；圖右數(shù)字代表該行末位核苷酸位點，起始密碼子和終止密碼子加方框顯示；多聚腺苷酸信號用斜體加下劃線表示。

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本文編號：2791983