發(fā)布時(shí)間：2020-08-07 06:33

【摘要】：鯽因其味道鮮美,已成為我國淡水養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)魚類,但因近年來皰疹病毒性造血器官壞死病(herpesviral haematopoietic necrosis,HVHN)給中國鯽魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,該病對(duì)鯽有高致死性,其病原主要是Ⅱ型鯉皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),所以建立快速、穩(wěn)定檢測(cè)鯽是否感染CyHV-2的方法防止CyHV-2的傳播是必要的,本實(shí)驗(yàn)室研究得出,CyHV-2-ORF121基因在病魚各個(gè)組織以及外周血中高表達(dá),可作為開展CyHV-2病毒診斷技術(shù)研發(fā)的潛在靶向檢測(cè)靶點(diǎn),所以制備了CyHV-2-ORF121的多克隆抗體從免疫學(xué)層面進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)正常鯽和感染CyHV-2的鯽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析測(cè)序結(jié)果顯示,感染CyHV-2的鯽相對(duì)于正常鯽的干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a基因顯著性上調(diào)。IRF基因在抵御病毒入侵、病原體應(yīng)答、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和造血細(xì)胞分化中都有重要作用,但其最重要的功能是參與干擾素(Interferon IFN)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。IRF在魚類中有11個(gè)家族成員(IRF1-11),根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為4個(gè)亞家族,IRF-1亞家族、IRF-3亞家族、IRF-4亞家族和IRF-5亞家族。在IRF家族成員的N端有高度保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD),包含IRF家族成員特有的色氨酸重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)室通過構(gòu)建pEGFP-IFN的真核表達(dá)質(zhì)粒注射鯽發(fā)現(xiàn)CyHV-2病毒粒子的復(fù)制效率下降,延遲并降低了鯽的死亡率。因?yàn)镮RF家族在IFN信號(hào)通路中的重要作用,所以對(duì)IRF家族成員的研究也在增加。本實(shí)驗(yàn)研究IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a這四個(gè)蛋白在組織中的表達(dá)特征和在poly(I:C)、LPS和CyHV-2的刺激下轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)其免疫功能進(jìn)行了初步研究。本研究制備了CyHV-2-ORF121多克隆抗體建立了免疫性更強(qiáng)的免疫學(xué)診斷技術(shù)和分析了病毒感染條件下以及poly(I:C)和LPS刺激下IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a的轉(zhuǎn)錄水平。研究主要包括以下三個(gè)內(nèi)容:(1)本研究的目的是針對(duì)CyHV-2病毒ORF121基因(Gene Bank:AFJ20543.1)行原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,純化重組蛋白作為抗原免疫小鼠獲得多克隆抗體,應(yīng)用該抗體開展CyHV-2病毒診斷及其感染機(jī)制研究。以CyHV-2病毒感染細(xì)胞上清液為擴(kuò)增模板,擴(kuò)增ORF121基因構(gòu)建至pGEX-4T原核表達(dá)載體。經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)rORF121重組蛋白利用尿素純化,免疫6周齡小鼠制備多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)目的重組蛋白rORF121,經(jīng)SDS-PAGE分析大小約為56 Ku,主要以不可溶的包涵體存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫小鼠獲得抗ORF121蛋白的多克隆抗體,可特異性識(shí)別CyHV-2病毒感染RyuF-2細(xì)胞樣品。進(jìn)一步研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2細(xì)胞后,本研究制備的抗ORF121蛋白的多克隆抗體能夠通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)特異性識(shí)別CyHV-2病毒的感染情況。本研究制備的抗ORF121蛋白的多克隆抗體能夠CyHV-2病毒診斷技術(shù)的構(gòu)建以及深入開展CyHV-2病毒感染機(jī)制提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。(2)本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組獲得的鯽IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a基因的開放閱讀框(ORF)序列進(jìn)行序列分析,鯽IRF1(CaIRF1)基因的ORF長(zhǎng)867 bp,編碼個(gè)288個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為33.21 Ku,CaIRF3基因N端DBD結(jié)構(gòu)域包含個(gè)6色氨酸重復(fù)。鯽IRF3基因的ORF長(zhǎng)1 278 bp,編碼425個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為48.51 Ku,鯽IRF3基因N端DBD結(jié)構(gòu)域包含4個(gè)色氨酸重復(fù),通過氨基酸比對(duì)顯示,鯽IRF3(CaIRF3)與犀角金線渻IRF3(SaIRF3),南亞野鯪IRF3(LrIRF3),黃鱔IRF3(MaIRF3),虹鱒魚IRF3(OmIRF3)的同源性分別為85.88%、69.41%、53.30%、50.88%。鯽IRF8(CaIRF8)基因的ORF長(zhǎng)1 299 bp,編碼432個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為48.96 Ku,鯽IRF8基因N端DBD結(jié)構(gòu)域包含5色氨酸重復(fù),通過氨基酸比對(duì)顯示,鯽IRF8(CaIRF8)與錦鯉IRF8(CcIRF8)、犀角金線渻IRF8(SaIRF8)、白魚IRF8(AgIRF8)、銀大麻哈魚IRF8(OkIRF8)的同源性分別為:89.35%、89.35%、78.22%、58%。鯽IRFIRF2bp2a(CaIRFIRF2bp2a)基因的ORF長(zhǎng)1 476 bp,編碼491個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量53.31 Ku,鯽IRF2bp2a基因N端DBD結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)色氨酸重復(fù),通過氨基酸比對(duì)顯示,鯽IRF2bp2a(CaIRFIRF2bp2a)與犀角金線渻IRF2bp2a(SaIRFIRF2bp2a)、錦鯉IRF2bp2a(CcIRFIRF2bp2a)、斑馬魚IRF2bp2a(DrIRFIRF2bp2a)、高體

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