【摘要】：急性肝胰腺壞死合綜合癥(Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS)是近年來(lái)影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。2009年以來(lái),AHPNS使得亞洲對(duì)蝦產(chǎn)量大幅下降,給亞洲養(yǎng)蝦業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,我國(guó)以凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖為主的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)亦受到較大沖擊。2013年,全球水產(chǎn)養(yǎng)殖聯(lián)盟(Global Aquaculture Alliance,GAA)發(fā)表聲明,明確了AHPNS的病原體是副溶血弧菌。據(jù)報(bào)道,該病原菌通過效應(yīng)蛋白PirA與PirB產(chǎn)生毒力,病蝦消化器官顏色蒼白,肝胰腺萎縮,空腸空胃,發(fā)病1~3天內(nèi)死亡率可達(dá)到100%。目前對(duì)于AHPNS的致病機(jī)理尚未研究清楚,尚無(wú)有效的防治手段見諸報(bào)道。本文通過分離得到了不同來(lái)源的凡納濱對(duì)蝦AHPNS致病菌,進(jìn)行了分子分型,獲得江蘇地區(qū)急性肝胰腺壞死綜合癥的分子流行病學(xué)資料;通過致病性弧菌拮抗菌的篩選相關(guān)研究,為該病的生態(tài)防控提供技術(shù)資料。2017~2018年間,江蘇省沿海地區(qū)連云港、鹽城和南通等市部分養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)不同程度的凡納濱對(duì)蝦急性死亡,發(fā)病對(duì)蝦呈現(xiàn)為空腸空胃,肝胰胰萎縮或腫漲,表現(xiàn)出AHPNS發(fā)病的典型癥狀。從上述數(shù)十家養(yǎng)殖場(chǎng)采集不同苗種來(lái)源、不同生長(zhǎng)階段、不同發(fā)病特點(diǎn)以及不同養(yǎng)殖模式的健康和疑似患AHPNS的凡納濱對(duì)蝦,無(wú)菌解剖其肝胰腺,分離得到642株細(xì)菌,分別采用急性肝胰腺壞死合綜合癥致病性相關(guān)基因pirA~(vp)引物AP3以及細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增,確認(rèn)并獲得28株凡納濱對(duì)蝦AHPNS致病性副溶血弧菌,根據(jù)不同的來(lái)源、模式等對(duì)所得菌株進(jìn)行了分類。應(yīng)用脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)技術(shù),對(duì)28株分離自江蘇省內(nèi)不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖模式、不同生長(zhǎng)階段的對(duì)蝦AHPNS發(fā)病個(gè)體肝胰腺的致病性副溶血弧菌進(jìn)行分子分型研究,最終得到了副溶血弧菌的4個(gè)主要的PFGE簇(G 1-G4),24個(gè)譜型,帶型間相似性達(dá)到86.1%-100%,表明各菌株親源關(guān)系較近,PFGE的分型結(jié)果與樣品來(lái)源的生長(zhǎng)地點(diǎn)、養(yǎng)殖模式、發(fā)病癥狀、苗種來(lái)源、對(duì)蝦生長(zhǎng)階段等具有相關(guān)性,說(shuō)明在江蘇省內(nèi)由副溶血弧菌引起的凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥的發(fā)生已經(jīng)存在流行趨勢(shì)。4個(gè)不同PFGE聚類簇的譜型存在一定的差異,這與28株菌的來(lái)源、養(yǎng)殖模式、發(fā)病癥狀以及發(fā)病對(duì)蝦不同生長(zhǎng)階段有關(guān)。本研究初步建立了江蘇省內(nèi)凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥弧菌的PFGE數(shù)據(jù)資料,以便在預(yù)警防控過程中快速將不同發(fā)病樣品或可疑對(duì)蝦樣品的副溶血性弧菌PFGE譜帶與本研究結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)同一來(lái)源對(duì)蝦個(gè)體具有共同的遺傳物質(zhì),在PFGE譜帶中表現(xiàn)出相同的指紋圖譜這一原理,分析菌株間的親緣關(guān)系,研究某疾病的傳染源、流行范圍等,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行疾病的預(yù)警預(yù)控,采取有效措施防控凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥。從江蘇南部沿海灘涂沉積物中分離得到252株細(xì)菌,以14株凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥致病性副溶血弧菌為指示菌,初篩和復(fù)篩后,獲得1株拮抗效果較好的菌株H 0011;通過形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rRNA基因序列鑒定為普羅威登斯菌。利用普羅威登斯菌H 0011對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行高密度脅迫安全性試驗(yàn)結(jié)果,試驗(yàn)期間浸浴組和投喂組對(duì)蝦狀態(tài)良好,沒有發(fā)病和死亡現(xiàn)象,該菌株對(duì)凡納濱對(duì)蝦是安全的。菌株H 0011的發(fā)酵工藝結(jié)果,該菌最佳發(fā)酵生長(zhǎng)條件為溫度為30℃、鹽度為10‰、pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為20 h。本文首次對(duì)江蘇地區(qū)不同苗種、不同地區(qū)、不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同養(yǎng)殖模式、不同死亡特點(diǎn)的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行了AHPNS致病性弧菌收集及分子分型,認(rèn)為江蘇省內(nèi)凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥已形成流行趨勢(shì),為進(jìn)一步開展江蘇地區(qū)急性肝胰腺壞死綜合癥的分子流行病學(xué)研究提供技術(shù)資料;首次獲得了對(duì)凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥具有防控作用的高效拮抗作用菌,為該病的防控提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S945.46
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文云港、鹽城地區(qū)的幾十份對(duì)蝦樣品中分離純化至 642 株可疑致病細(xì)菌菌株。2.2.2AHPNS 病原菌的確認(rèn)及鑒定通過 AP 3 擴(kuò)增 642 株細(xì)菌菌株的 AP 3 序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，編號(hào) H289 等 28 株菌株在 333 bp 大小處有明亮條帶（圖 2-1），與目標(biāo)條帶大小一致。結(jié)果表明，這 28 株菌株為 AHPNS 的致病性細(xì)菌。

29圖 3-1 28 株副溶血弧菌 PFGE 分子分型結(jié)果Figure 3 28 Molecular Typing of Vibrio parahaemolyticus PFGE3.3.2 28 株副溶血弧菌 PFGE 簇不同地點(diǎn)的分布南通地區(qū)的菌株在各譜系中分布均衡，均有存在；鹽城地區(qū)以 G 4 PFGE 簇w 主（5/10），同時(shí)也較均勻分布于 G 1、G 2 和 G 3 PFGE 簇中；連云港地區(qū)菌株只有 2 株，以 G 1 為主，同源性 100 %。具體見表 3-1。

圖 4-1 基于 16S rDNA 序列的菌株 H0011 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4-1 Phylogenetic Tree of Strain H0011 Based on 16S rDNA Sequence4.1.6.3 安全性實(shí)驗(yàn)通過高濃度脅迫實(shí)驗(yàn)測(cè)試篩選菌株 H0011 的結(jié)果如表 4-3 所示。浸浴組1×108cfu/mL、1×109cfu/mL 條件下的凡納濱對(duì)蝦，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中健康，且攝食正常又活力良好，無(wú)空腸和死亡現(xiàn)象；浸浴組 1×1010cfu/mL 的三個(gè)平行組中有一組對(duì)蝦出現(xiàn) 1 尾空腸現(xiàn)象。投喂組對(duì)蝦在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中健康，且攝食正常又活力良好，無(wú)空腸和死亡現(xiàn)象。試驗(yàn)期間，浸浴組空白對(duì)照組對(duì)蝦無(wú)死亡，但其中有一組出現(xiàn) 1 尾空腸現(xiàn)象。因此 108cfu/mL 濃度以下的浸浴組和投喂組與生理鹽水組無(wú)顯著性差異（P㧐0.05）。

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本文編號(hào)：2782601