【摘要】：造血作用是一系列的復(fù)雜過程,包括不同類型的血細(xì)胞從特定的造血位點發(fā)生、發(fā)育以及成熟。造血作用中生成的形態(tài)各異的血細(xì)胞(免疫細(xì)胞),構(gòu)成了機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的核心和基礎(chǔ),因此了解造血作用中血細(xì)胞的發(fā)生、分化及其相應(yīng)的免疫功能,是探究機(jī)體免疫防御機(jī)制的前提和關(guān)鍵切入點。由于無脊椎動物缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng),它們主要依賴固有免疫系統(tǒng)抵御病原入侵,而其中由細(xì)胞免疫發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,細(xì)胞免疫所需要的血淋巴細(xì)胞主要通過造血作用快速補充。中華絨螯蟹是一種主要養(yǎng)殖于亞洲南部的重要經(jīng)濟(jì)甲殼動物,成體內(nèi)存在獨立的造血組織。本研究以中華絨螯蟹為研究對象,鑒定了其成體造血組織的特征,利用流式細(xì)胞儀分選了不同血淋巴細(xì)胞亞群,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,探究了造血過程,闡述了活性氧(reactive oxygen species,ROS)和甲殼動物細(xì)胞因子Es Astakine對造血過程的調(diào)控機(jī)制。中華絨螯蟹的造血組織位于其胃的背側(cè),為一層一系列的卵圓形囊泡構(gòu)成的薄膜。其中的囊泡內(nèi)含有大量細(xì)胞核相對較大的圓形細(xì)胞。這些細(xì)胞由結(jié)締組織包裹,含有大量線粒體,并且多數(shù)造血組織細(xì)胞處于有絲分裂前期和中期。EdU標(biāo)記實驗也證明了造血組織細(xì)胞呈現(xiàn)出相當(dāng)旺盛的DNA復(fù)制活動。造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx1特異性表達(dá)在中華絨螯蟹造血組織中,可能存在3個不同的蛋白異構(gòu)體。GATA1在造血組織和血淋巴細(xì)胞中均有表達(dá),但可能以不同的蛋白異構(gòu)體形式存在,參與新生血淋巴細(xì)胞的成熟與釋放。通過流式細(xì)胞儀分選,中華絨螯蟹的血淋巴細(xì)胞被分為P1和P2。P1型血淋巴細(xì)胞形狀較小,內(nèi)含大量著色較深的嗜酸性顆粒,因此可能主要為粒細(xì)胞。P2型血淋巴細(xì)胞大小不一且顆粒度較小,可能主要由透明細(xì)胞和半粒細(xì)胞組成。正常條件下,P1和P2型血淋巴細(xì)胞都具有吞噬能力,并且吞噬率相似。但是LPS刺激之后,P1型血淋巴細(xì)胞的吞噬率顯著性上升,而P2型血淋巴細(xì)胞未出現(xiàn)顯著性變化,表明P1型血淋巴細(xì)胞是中華絨螯蟹中行使吞噬功能的主要細(xì)胞類群。此外,P1型血淋巴細(xì)胞中的ROS、溶酶體及鈣離子水平也顯著高于P2型血淋巴細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果表明,病原識別、吞噬、殺菌、溶酶體以及抗氧化作用相關(guān)的基因在P1血淋巴細(xì)胞中特異性高表達(dá);而酚氧化物酶原激活系統(tǒng)相關(guān)的基因在P2血淋巴細(xì)胞中顯著性高表達(dá)。P1血淋巴細(xì)胞為免疫應(yīng)答中行使吞噬功能的主要細(xì)胞類群,但仍有超過80%的P1血淋巴細(xì)胞不具有吞噬能力,同時造血組織細(xì)胞也具有一定的吞噬能力,結(jié)果也揭示了中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞并沒有完全特化,可能由多種細(xì)胞共同發(fā)揮類似作用。本研究也構(gòu)建了造血組織和血淋巴細(xì)胞的六個轉(zhuǎn)錄文庫,共得到51,229,690條單邊變長的序列,拼接后共得到31,346個基因作為參考基因組。經(jīng)過組裝之后,共篩選出362個差異表達(dá)基因。造血組織中高表達(dá)的301個基因富集在與DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂以及能量代謝相關(guān)功能群。其中與線粒體ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因mitochondrial complexes I在造血組織中的表達(dá)水平是血淋巴細(xì)胞中的8.6倍。這些上調(diào)基因表明了造血組織中具有旺盛的細(xì)胞分裂活動以及氧化還原反應(yīng)。在61個血淋巴細(xì)胞上調(diào)的基因中,參與酚氧化酶原(prophenoloxidase,pro PO)激活的蛋白酶以及proPO大量富集,表明proPO可能作為成熟血淋巴細(xì)胞的標(biāo)記分子。和血淋巴細(xì)胞相比,造血組織中的ROS水平相對較高。當(dāng)造血組織中的ROS被其清除劑NAC清除之后,可以延遲由嗜水氣單胞菌刺激引起的血淋巴細(xì)胞增多。推測ROS可促進(jìn)造血組織中細(xì)胞的增殖和分化,是中華絨螯蟹造血的重要調(diào)節(jié)因子。Astakine是甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的參與造血的細(xì)胞因子。本研究從中華絨螯蟹的EST庫中鑒定并克隆得到了一個全長為1163 bp的EsAstakine基因,其編碼一個128個氨基酸的短肽。EsAstakine二級結(jié)構(gòu)包括一個信號肽結(jié)構(gòu)域和一個前動力蛋白結(jié)構(gòu)域,其中有9個保守的半胱氨酸殘基。EsAstakine與淡水龍蝦和斑節(jié)對蝦中的Astakine在序列和進(jìn)化上更為接近。EsAstakine的mRNA主要在血淋巴細(xì)胞和肝胰腺組織中表達(dá),并且鰻弧菌和畢赤酵母的刺激可以顯著提高血淋巴細(xì)胞中EsAstakine的表達(dá)量。在嗜水氣單胞菌的刺激下,EsAstakine的表達(dá)水平和血淋巴細(xì)胞的總數(shù)變化趨勢一致。注射EsAstakine重組蛋白可以顯著提高血淋巴細(xì)胞的總數(shù)和造血組織細(xì)胞的ROS水平,也可以引起JNK和mTOR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平上升。EsAstakine的RNA干擾可以顯著延遲由嗜水氣單胞菌刺激引起的血淋巴細(xì)胞增多并且減少造血組織細(xì)胞的DNA復(fù)制活動。同時,線粒體上的ROS重要產(chǎn)生基因mitochondrial complexes I的干擾,不僅降低造血組織細(xì)胞的ROS水平,同時顯著抑制由EsAstakine的重組蛋白注射引起的血淋巴細(xì)胞數(shù)目的增多。上述結(jié)果表明在病原刺激條件下,血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量EsAstakine,EsAstakine隨循環(huán)系統(tǒng)作用于造血組織細(xì)胞,引起胞內(nèi)ROS水平上升,可能通過激活JNK通路,促進(jìn)造血細(xì)胞的分化以及血淋巴細(xì)胞的再生。綜上所述,中華絨螯蟹存在特化的造血組織和功能上有一定分化的血淋巴細(xì)胞亞群。ROS能夠促進(jìn)造血組織細(xì)胞的增殖和分化。EsAstakine通過ROS依賴的信號通路促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖及血淋巴細(xì)胞的再生。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

中華絨螯蟹造血組織及造血作用機(jī)理的研究造血干細(xì)胞依靠它所在微環(huán)境（niche）來調(diào)節(jié)其自我更新以及分化能力[3]。Niche（圖 1-2）是指在組織解剖學(xué)上干細(xì)胞所處的特定位置，它可以通過與干細(xì)胞之間的相互作用來調(diào)節(jié)干細(xì)胞的命運。在胚胎發(fā)育的過程中，niche 中的許多因子作用于胚胎干細(xì)胞，從而誘導(dǎo)它們增殖和分化來促進(jìn)胚胎的發(fā)育。在成體中，干細(xì)胞的 niches維持成熟干細(xì)胞長期處于靜息狀態(tài)，但是在組織受到損傷之后，周圍的微環(huán)境活躍地將信號傳遞到干細(xì)胞中來促進(jìn)它們的更新和分化從而形成新的組織[4]。Niche 中干細(xì)胞發(fā)揮其特定功能是由以下一些重要因素調(diào)節(jié)的：干細(xì)胞與干細(xì)胞之間的相互作用，干細(xì)胞與相鄰的已經(jīng)分化的細(xì)胞之間的相互作用，干細(xì)胞與細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)、氧張力、生長因子、細(xì)胞因子、環(huán)境的物理性質(zhì)如 PH、離子以及一些代謝物（如 ATP）之間的相互反應(yīng)。干細(xì)胞和其 niche 之間是相互依賴、互惠共存的[5]。

第一章 緒論持，包括血管外周基質(zhì)細(xì)胞（perivascular stromal cells）、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells）、巨噬細(xì)胞（macrophages）、交感神經(jīng)元（sympathetic neurons）和非髓鞘化的施萬細(xì)胞（nonmyelinating Schwann cell）。CXCL2 和 SCF 是已知的維持造血干細(xì)胞功能的重要因子，以及其它一些調(diào)節(jié)因子包括多效生長因子（pleiotrophin）、血管生成素1（angiopoietin 1）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）。Notch 和 Wnt 信號通路也在其中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用（圖 1-3）。然而骨細(xì)胞（osteoblasts）對于維持造血干細(xì)胞來說并不是必不可少的但是它們對于淋巴前體細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用[8, 9]。

用主要分為兩個階段[14]（圖 1-4）。第一個階段發(fā)生在早期胚胎的頭部中胚層，主要是由造血前體細(xì)胞（prohemocytes）分化形成晶細(xì)胞（crystal cells）和漿細(xì)胞（plasmatocytes）[15]。漿細(xì)胞具有和高等哺乳類動物巨噬細(xì)胞類似的功能，它們可以吞噬入侵的病原體或者自身凋亡的細(xì)胞[16]。晶細(xì)胞是原始的血小板，它們在創(chuàng)傷修復(fù)以及病原殺傷過程中起到關(guān)鍵作用[17]。由造血前體細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞或者晶細(xì)胞需要特定的轉(zhuǎn)錄因子 Gcm（Glide/Glial Cell Missing）或者 L（RUNX transcription factor Lozenge）參與調(diào)節(jié)[18-20]。胚胎時期產(chǎn)生的血細(xì)胞將依然存在于幼體階段，它們可以在角質(zhì)層形成細(xì)胞簇或者在血淋巴中作為循環(huán)血淋巴細(xì)胞[21-22]。在幼體階段，另一階段的造血作用發(fā)生于淋巴結(jié)器官，干細(xì)胞樣的造血前體細(xì)胞可以在此產(chǎn)生成熟的血淋巴細(xì)胞[23]。胚胎和幼體時期產(chǎn)生的血淋巴細(xì)胞都可以存留到成體階段并且成體中的各個部位中都可以找到它們，它們在成體中發(fā)揮這不可或缺的作用[24]。

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本文編號：2782503