【摘要】：造血作用是一系列的復(fù)雜過程,包括不同類型的血細胞從特定的造血位點發(fā)生、發(fā)育以及成熟。造血作用中生成的形態(tài)各異的血細胞(免疫細胞),構(gòu)成了機體細胞免疫和體液免疫的核心和基礎(chǔ),因此了解造血作用中血細胞的發(fā)生、分化及其相應(yīng)的免疫功能,是探究機體免疫防御機制的前提和關(guān)鍵切入點。由于無脊椎動物缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng),它們主要依賴固有免疫系統(tǒng)抵御病原入侵,而其中由細胞免疫發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,細胞免疫所需要的血淋巴細胞主要通過造血作用快速補充。中華絨螯蟹是一種主要養(yǎng)殖于亞洲南部的重要經(jīng)濟甲殼動物,成體內(nèi)存在獨立的造血組織。本研究以中華絨螯蟹為研究對象,鑒定了其成體造血組織的特征,利用流式細胞儀分選了不同血淋巴細胞亞群,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,探究了造血過程,闡述了活性氧(reactive oxygen species,ROS)和甲殼動物細胞因子Es Astakine對造血過程的調(diào)控機制。中華絨螯蟹的造血組織位于其胃的背側(cè),為一層一系列的卵圓形囊泡構(gòu)成的薄膜。其中的囊泡內(nèi)含有大量細胞核相對較大的圓形細胞。這些細胞由結(jié)締組織包裹,含有大量線粒體,并且多數(shù)造血組織細胞處于有絲分裂前期和中期。EdU標記實驗也證明了造血組織細胞呈現(xiàn)出相當(dāng)旺盛的DNA復(fù)制活動。造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx1特異性表達在中華絨螯蟹造血組織中,可能存在3個不同的蛋白異構(gòu)體。GATA1在造血組織和血淋巴細胞中均有表達,但可能以不同的蛋白異構(gòu)體形式存在,參與新生血淋巴細胞的成熟與釋放。通過流式細胞儀分選,中華絨螯蟹的血淋巴細胞被分為P1和P2。P1型血淋巴細胞形狀較小,內(nèi)含大量著色較深的嗜酸性顆粒,因此可能主要為粒細胞。P2型血淋巴細胞大小不一且顆粒度較小,可能主要由透明細胞和半粒細胞組成。正常條件下,P1和P2型血淋巴細胞都具有吞噬能力,并且吞噬率相似。但是LPS刺激之后,P1型血淋巴細胞的吞噬率顯著性上升,而P2型血淋巴細胞未出現(xiàn)顯著性變化,表明P1型血淋巴細胞是中華絨螯蟹中行使吞噬功能的主要細胞類群。此外,P1型血淋巴細胞中的ROS、溶酶體及鈣離子水平也顯著高于P2型血淋巴細胞。RT-PCR結(jié)果表明,病原識別、吞噬、殺菌、溶酶體以及抗氧化作用相關(guān)的基因在P1血淋巴細胞中特異性高表達;而酚氧化物酶原激活系統(tǒng)相關(guān)的基因在P2血淋巴細胞中顯著性高表達。P1血淋巴細胞為免疫應(yīng)答中行使吞噬功能的主要細胞類群,但仍有超過80%的P1血淋巴細胞不具有吞噬能力,同時造血組織細胞也具有一定的吞噬能力,結(jié)果也揭示了中華絨螯蟹血淋巴細胞并沒有完全特化,可能由多種細胞共同發(fā)揮類似作用。本研究也構(gòu)建了造血組織和血淋巴細胞的六個轉(zhuǎn)錄文庫,共得到51,229,690條單邊變長的序列,拼接后共得到31,346個基因作為參考基因組。經(jīng)過組裝之后,共篩選出362個差異表達基因。造血組織中高表達的301個基因富集在與DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成、細胞分裂以及能量代謝相關(guān)功能群。其中與線粒體ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因mitochondrial complexes I在造血組織中的表達水平是血淋巴細胞中的8.6倍。這些上調(diào)基因表明了造血組織中具有旺盛的細胞分裂活動以及氧化還原反應(yīng)。在61個血淋巴細胞上調(diào)的基因中,參與酚氧化酶原(prophenoloxidase,pro PO)激活的蛋白酶以及proPO大量富集,表明proPO可能作為成熟血淋巴細胞的標記分子。和血淋巴細胞相比,造血組織中的ROS水平相對較高。當(dāng)造血組織中的ROS被其清除劑NAC清除之后,可以延遲由嗜水氣單胞菌刺激引起的血淋巴細胞增多。推測ROS可促進造血組織中細胞的增殖和分化,是中華絨螯蟹造血的重要調(diào)節(jié)因子。Astakine是甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的參與造血的細胞因子。本研究從中華絨螯蟹的EST庫中鑒定并克隆得到了一個全長為1163 bp的EsAstakine基因,其編碼一個128個氨基酸的短肽。EsAstakine二級結(jié)構(gòu)包括一個信號肽結(jié)構(gòu)域和一個前動力蛋白結(jié)構(gòu)域,其中有9個保守的半胱氨酸殘基。EsAstakine與淡水龍蝦和斑節(jié)對蝦中的Astakine在序列和進化上更為接近。EsAstakine的mRNA主要在血淋巴細胞和肝胰腺組織中表達,并且鰻弧菌和畢赤酵母的刺激可以顯著提高血淋巴細胞中EsAstakine的表達量。在嗜水氣單胞菌的刺激下,EsAstakine的表達水平和血淋巴細胞的總數(shù)變化趨勢一致。注射EsAstakine重組蛋白可以顯著提高血淋巴細胞的總數(shù)和造血組織細胞的ROS水平,也可以引起JNK和mTOR信號通路相關(guān)基因的表達水平上升。EsAstakine的RNA干擾可以顯著延遲由嗜水氣單胞菌刺激引起的血淋巴細胞增多并且減少造血組織細胞的DNA復(fù)制活動。同時,線粒體上的ROS重要產(chǎn)生基因mitochondrial complexes I的干擾,不僅降低造血組織細胞的ROS水平,同時顯著抑制由EsAstakine的重組蛋白注射引起的血淋巴細胞數(shù)目的增多。上述結(jié)果表明在病原刺激條件下,血淋巴細胞產(chǎn)生大量EsAstakine,EsAstakine隨循環(huán)系統(tǒng)作用于造血組織細胞,引起胞內(nèi)ROS水平上升,可能通過激活JNK通路,促進造血細胞的分化以及血淋巴細胞的再生。綜上所述,中華絨螯蟹存在特化的造血組織和功能上有一定分化的血淋巴細胞亞群。ROS能夠促進造血組織細胞的增殖和分化。EsAstakine通過ROS依賴的信號通路促進造血細胞的增殖及血淋巴細胞的再生。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

中華絨螯蟹造血組織及造血作用機理的研究造血干細胞依靠它所在微環(huán)境（niche）來調(diào)節(jié)其自我更新以及分化能力[3]。Niche（圖 1-2）是指在組織解剖學(xué)上干細胞所處的特定位置，它可以通過與干細胞之間的相互作用來調(diào)節(jié)干細胞的命運。在胚胎發(fā)育的過程中，niche 中的許多因子作用于胚胎干細胞，從而誘導(dǎo)它們增殖和分化來促進胚胎的發(fā)育。在成體中，干細胞的 niches維持成熟干細胞長期處于靜息狀態(tài)，但是在組織受到損傷之后，周圍的微環(huán)境活躍地將信號傳遞到干細胞中來促進它們的更新和分化從而形成新的組織[4]。Niche 中干細胞發(fā)揮其特定功能是由以下一些重要因素調(diào)節(jié)的：干細胞與干細胞之間的相互作用，干細胞與相鄰的已經(jīng)分化的細胞之間的相互作用，干細胞與細胞粘附分子、細胞外基質(zhì)、氧張力、生長因子、細胞因子、環(huán)境的物理性質(zhì)如 PH、離子以及一些代謝物（如 ATP）之間的相互反應(yīng)。干細胞和其 niche 之間是相互依賴、互惠共存的[5]。

第一章 緒論持，包括血管外周基質(zhì)細胞（perivascular stromal cells）、內(nèi)皮細胞（endothelial cells）、巨噬細胞（macrophages）、交感神經(jīng)元（sympathetic neurons）和非髓鞘化的施萬細胞（nonmyelinating Schwann cell）。CXCL2 和 SCF 是已知的維持造血干細胞功能的重要因子，以及其它一些調(diào)節(jié)因子包括多效生長因子（pleiotrophin）、血管生成素1（angiopoietin 1）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）。Notch 和 Wnt 信號通路也在其中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用（圖 1-3）。然而骨細胞（osteoblasts）對于維持造血干細胞來說并不是必不可少的但是它們對于淋巴前體細胞具有重要的調(diào)節(jié)作用[8, 9]。

用主要分為兩個階段[14]（圖 1-4）。第一個階段發(fā)生在早期胚胎的頭部中胚層，主要是由造血前體細胞（prohemocytes）分化形成晶細胞（crystal cells）和漿細胞（plasmatocytes）[15]。漿細胞具有和高等哺乳類動物巨噬細胞類似的功能，它們可以吞噬入侵的病原體或者自身凋亡的細胞[16]。晶細胞是原始的血小板，它們在創(chuàng)傷修復(fù)以及病原殺傷過程中起到關(guān)鍵作用[17]。由造血前體細胞分化成為漿細胞或者晶細胞需要特定的轉(zhuǎn)錄因子 Gcm（Glide/Glial Cell Missing）或者 L（RUNX transcription factor Lozenge）參與調(diào)節(jié)[18-20]。胚胎時期產(chǎn)生的血細胞將依然存在于幼體階段，它們可以在角質(zhì)層形成細胞簇或者在血淋巴中作為循環(huán)血淋巴細胞[21-22]。在幼體階段，另一階段的造血作用發(fā)生于淋巴結(jié)器官，干細胞樣的造血前體細胞可以在此產(chǎn)生成熟的血淋巴細胞[23]。胚胎和幼體時期產(chǎn)生的血淋巴細胞都可以存留到成體階段并且成體中的各個部位中都可以找到它們，它們在成體中發(fā)揮這不可或缺的作用[24]。

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本文編號：2782503