發(fā)布時(shí)間：2020-08-05 20:14

【摘要】：草魚(Ctenopharyngodon idella)是中國經(jīng)濟(jì)上重要的淡水魚類,占淡水漁業(yè)總產(chǎn)量的比例較高,但由于水中的病原體引起各種病害的頻發(fā)給產(chǎn)值造成了一定的影響。先天免疫是魚類免疫系統(tǒng)的重要防線,能夠通過模式識別受體(PRRs)識別病原體結(jié)構(gòu),從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此,有必要研究草魚的先天免疫基因,為培育抗病能力較強(qiáng)的草魚新品種提供新的思路。生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)45-Beta(Gadd45B)對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性至關(guān)重要,并參與調(diào)節(jié)生長,凋亡和DNA去甲基化。在本研究中,克隆了草魚中g(shù)cGadd45Ba和gcGadd45Bb基因的全長cDNA,分析序列并用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)作為病原體模型處理草魚個(gè)體和細(xì)胞,研究這些基因在草魚個(gè)體及細(xì)胞在細(xì)菌感染后的的表達(dá)情況,并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建過表達(dá)載體以及重組蛋白對基因的功能進(jìn)行探究,取得了如下的結(jié)果:1.從草魚轉(zhuǎn)錄組中獲得gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的cDNA短片段,設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證其準(zhǔn)確性,并通過RACE技術(shù)獲得全長序列。gcGadd45Ba的全長cDNA為1279bp,包括650bp的5'-非翻譯區(qū)(UTR),149bp的3'-UTR,以及480bp的ORF,編碼159個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子量為17.91 kDa,理論等電點(diǎn)為4.38。gcGadd45Bb的全長cDNA為1190bp,包括564bp的5'-UTR,140bp的3'-UTR和486bp的ORF,它編碼的蛋白質(zhì)為161個(gè)氨基酸,分子量為17.97kDa,理論等電點(diǎn)為4.51。分析其氨基酸序列得知,gcGadd45Ba編碼的蛋白質(zhì)不具有疏水區(qū)域,gcGadd45Bb編碼的蛋白質(zhì)具有弱疏水區(qū)域,為我們合成其可溶性重組蛋白提供了可能。2.gcGadd45Ba和gcGadd45Bb正常組織熒光定量PCR結(jié)果顯示它們在草魚的所有測試組織中表達(dá)。且gcGadd45Ba基因表達(dá)在肝臟,心臟,肌肉,皮膚,血液和脾臟中相對較高。gcGadd45Bb基因在血液,鰭,心臟和脾臟中的表達(dá)相對較高。除了鰭和鰓之外,gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的水平在所有測試組織中顯示出顯著差異。免疫組織的表達(dá)量結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌感染后gcGadd45Ba和gcGadd45Bb有顯著的免疫應(yīng)答,4 h和12 h之間的表達(dá)水平呈上升趨勢,12 h和72 h之間逐漸下降,并且gcGadd45Ba存在在脾臟中高度表達(dá),gcGadd45Bb在頭腎中高表達(dá)的現(xiàn)象。3.通過構(gòu)建gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞后檢測下游相關(guān)免疫因子(IL-8、IL-1β、TNF-α)的轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果表明,該途徑下游的免疫因子的轉(zhuǎn)錄可以被顯著激活。并且在抑菌實(shí)驗(yàn)中可以看出,在過表達(dá)目的基因的CIK細(xì)胞能夠顯著的抑制細(xì)菌入侵效率。4.在草魚體外表達(dá)并純化gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的重組蛋白,設(shè)計(jì)血細(xì)胞吞噬細(xì)菌的實(shí)驗(yàn),通過使細(xì)菌攜帶FITC熒光標(biāo)記,通過流式細(xì)胞術(shù)測量熒光信號以測量重組蛋白對血液吞噬細(xì)菌效率的影響。結(jié)果顯示gcGadd45Ba和gcGadd45Bb均存在血清依賴性的促血細(xì)胞吞噬作用。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

在魚類中被鑒定出不同的亞型，目前已經(jīng)在斑馬魚（DaniorerCynoglossus semILaevis）[11]中被報(bào)道。本文通過概述草魚 Gad型 gcGadd45Ba 和 gcGadd45Bb 的相關(guān)信息以及研究進(jìn)展，希望性研究提供更多的理論依據(jù)。d45B 的結(jié)構(gòu)分析 Gadd45B 基因的氨基酸序列與其他物種具有高度的保守性，具的 Ribosomal_L7Ae 超家族結(jié)構(gòu)域[12]。在人中被描述其蛋白的 N狀 α/β 折疊，在 N 末端和一個(gè)環(huán)上具有兩個(gè)長的無序和柔性區(qū)于在 N 末端截短的鼠 Gadd45G 同種型構(gòu)建體的最近晶體結(jié)構(gòu) 1-1）[13]。我們所表征的草魚 Gadd45B 基因可能具有相同的結(jié)并且分析其序列可知 gcGadd45Ba 不具有疏水區(qū)域，而 gcGadd水區(qū)域。

圖 2-1 gcGadd45Ba 基因序列的甲基化 CpG 島預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)三個(gè) CpG 島，圖中陰影部分。Fig. 2-1 Methylated CpG island prediction of the gcGadd45Ba gene sequence revealed a total of threeCpG islands, shaded in the figure.

16圖 2-2 gcGadd45Bb 基因序列的甲基化 CpG 島預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)兩個(gè) CpG 島，圖中陰影部分。Fig. 2-2 Methylated CpG island prediction of the gcGadd45Bb gene sequence revealed two CpGislands, shaded in the figure.2.2.2 多重序列比對與進(jìn)化樹分析多重序列比對顯示 gcGadd45Ba 和 gcGadd45Bb 具有 76%的同一性，兩者氨基

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孟躍華,紀(jì)國良,劉衛(wèi)紅;溫度對草魚血液吞噬細(xì)胞吞噬作用的影響[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1990年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉萬軍;半滑舌鰨Gadd45g基因的克隆、功能分析和染色體熒光原位雜交[D];中國海洋大學(xué);2014年

本文編號：2781820